纤维素资源和纤维素酶是各国研究的热点领域，其中细菌产的碱性纤维素酶是研究的一个重要方面，碱性纤维素酶在洗涤、纺织、造纸、环保等行业都有广阔的应用前景。
碱性纤维素酶于20世纪70年代被发现，主要由在碱性环境中生长的芽孢杆菌和链霉菌产生。近年来，嗜碱性细菌作为新型的微生物资源倍受人们关注。在理论研究方面，其嗜碱机理引起了人们广泛的兴趣；在应用方面，其稳定地产生碱性胞外酶日益引人注目，特别是碱性纤维素酶在洗涤工业上的成功应用，改变了传统的去污机制，建立了一套新的去污机理，被洗涤剂工业称为一次技术大革命，使碱性纤维素酶成为世界各国普遍重视的一种极具生命力的新型酶制剂[1]。
一、产碱性纤维素酶的微生物
碱性微生物可分为嗜碱菌和耐碱菌，在pH8以上能生长的微生物称之为嗜碱菌；最适pH是中性，但在碱性条件下也能生长的微生物称为耐碱菌。碱性微生物在自然界中主要分布在碱性环境中，在pH9-10的土壤中，碱性菌多达每克10 5-6个，而pH4-5仅有每克101-3个[2]。
碱性菌具有独特的生理特性，能够改变周围环境的酸碱度，使之适合于自身的生长，即使培养基的初始 pH为11或6，培养数日后，会趋向生长最适pH；钠离子对生长发育影响较大，培养基中只加入0.15mol/LNaCl，菌体生长浓度比不加的增加2-3倍[3]。
目前，国内外报道的产碱性纤维素酶微生物中有中性，嗜碱性芽孢杆菌、放线菌、霉菌等，但产酶活力高、pH性能稳定且已工业化生产的菌株只有嗜碱性芽孢杆菌，它具有生长繁殖快、易于诱变处理等特点[4]。
二、碱性纤维素酶产生菌的分离方法
碱性纤维素酶产生菌株的分离方法有很多，其中平板降解圈直接分离法有着快速、简捷、准确、可靠的特点。其原理是待分离的菌株分泌CMC酶，能作用于底物CMC（一般用羧甲基纤维素的钠盐也简称CMC来代替）。CMC属于大分子多糖衍生物，它被降解后生成多种分子量不等的低聚糖。根据上述特征，人们采用了多种平板降解圈分离法来筛选分离产生CMCase的菌株[5,6]。简要介绍于下：
1、CMC－天青法（CMC-azure）
这是一种将CMC与染料天青偶联后作为酶的底物，CMC－天青被CMCase降解后，染料天青被释放出来，挑选在菌落周围有染色圈的菌株即为CMCase的菌株
2、凉乙醇沉淀法（precipitation with chilled ethanol）
生长到适当时间的平板菌落，先经过影印移植后，再用冷却到4℃的乙醇倾倒平板，乙醇将没有被降解的CMC沉淀下来，这样，在产CMCase的菌落周围就会存在清晰的透明圈。
3、 Unitex染色法（Unitex dyes）
将培养适当时间平板用Unitex染料浸染平板，而后放到紫外灯下观察，菌落周围有晕圈者，即产CMCase。
4、 台盼兰法（trypan blue）
将0.0075%的台盼兰染料作为一种成分，直接加入到分离培养基中，培养一定时间后，在菌落周围产生较明显降解圈者即产CMCase。
5、 刚果红法（congo red）
将培养适当时间平板用0.1%的刚果红不溶液浸染一定时间后，再用1mol/LNaCl不溶液脱色，刚果红将未被降解的CMC染成红色，而对已被降解的小分子低聚糖类作用，因此在产CMCase的菌落周围留下了清晰的透明圈。
在上述几种平板降解圈直接分离产CMCase的菌株的方法中，以刚果红法为最好。其他的方法有的受底物的限制，有的灵敏度低，需培养较长时间，有的因杀死菌体而需影印移植，这就造成了诸多不便。而采用刚果红法刚避免了上述缺点，刚果红对菌体无任何不良影响，产生的透明圈清晰易辨，特别是它的灵敏度较高，只要菌落长到肉可见即可产生清晰的透明圈。
三、碱性纤维素酶产生菌的筛选与培养条件研究
碱性纤维酶的研究比较晚，但发展得很快。日本学者对碱性纤维素酶进行了大量的研究。1970年，UNILIVER公司首先发现纤维素酶用于洗涤剂，可以使由于反复洗涤而发黄变硬的棉纤维织品恢复原来的洁白和柔软，但当时在碱性范围内具有较高活性的纤维素酶还没有实现工业化。1972年horikoshi报道发现了嗜碱芽孢杆菌No.N-1、N-2、N-3和N-4能产生碱性纤维素酶，但酶活性很低。1974年日本东京工业大学研究了奢碱性芽孢杆菌N-1、N-4产的酶为分解代谢阻遏型。一直到1980年，NOVO公司发现了在碱性范围有较高活性的腐植菌，通过液体发酵，成功地生产了洗涤剂用碱性纤维素酶，并很快得到应用。1984年日本KAO公司Susumu ITO等人，利用含有刚果红染料的CMC培养基，分离了上万株能够产生较高活性的碱性纤维素酶产生菌。其中，芽孢杆菌KSM-635是产生去污力强，酶活又高的优良菌株。1985年，Fumiy-asu Fukumori经研究指出添加葡萄糖会强烈抑制嗜碱性芽孢杆菌No.1139产酶，该菌在37℃培养3d后的产酶活力为0.83U/mL。1988年，Shuyi Kawai的研究表明中性菌芽孢杆菌KSM-522产酶的最佳碳源是麦芽糖，该菌在30℃培养3d后，酶活力为1.38U/mL-1.70U/mL。1990年，Shituw Shikata发现了3株诱导型产酶菌KSM-19,KSM-64,KSM-520在最佳培养条件下，酶活力分别是1.6U/mL、5.2U/mL和3.3U/mL。在这些研究中，日本花王公司的组成型碱性纤维素酶产生菌嗜碱性芽孢杆菌KSM-635的研究进展最为显著。分别用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖作为碳源，可使酶活提高将近2倍；用半连续法，在菌体生长对数期或延滞期，用新鲜培养液代替30%-99.9%的培养液，到第8批连续培养时，酶活提高3倍；在培养液中加入0.5%木聚糖，30℃培养3天，酶活力提高3倍；以抗生素万古霉素、瑞斯托菌素为筛子，用甲基磺酸乙酯、亚硝基胍等进行诱变，筛选抗性菌株，酶活提高4倍。在培养基中加入3×108g/L-100×108g/L含铁无机盐或300×108g/L的肌红蛋白，能使酶活由20U/mL提高到40-60U/ml，也是当时报道的最高的。
我国对碱性纤维素酶的研究工作还处于初始阶段：我国于1990年分离得到一株能够产生1000u/L的野生菌，芽孢杆菌074生产的碱性纤维素酶最适反应pH为7-8，在pH4-11可维持50%酶活力；最适反应温度为50℃；不能分解天然纤维素；CMC对酶的合成无诱导作用；除Hg+、Ag+、Zn2+、Cu2+等少数离子及少数洗涤剂助剂对酶活性有一定的影响外，酶活性相当稳定。
浙江大学生物工程与化学工程系的沈雪亮[7]，通过发酵条件优化，将芽孢杆菌Bacillus sp.ZU-04的酶活提高到125.6U/mL，这是在国内文献中同样的测定方法前提下所查到的最高酶活力。
四、碱性纤维素酶的特点
无锡轻工大学承担的国家八五科技攻关项目“洗涤剂用碱性纤维素酶的研究与开发”，对碱性纤维素酶的开发成功，对国内的酶制剂、洗涤工业的发展均有重大的促进作用。他们的研究证实，碱性纤维素酶主要具有以下几个特点：
1）最适反应pH8-10左右，作用pH可达3-12.5之广。
2）耐碱性强，在碱性环境里酶活稳定，在pH12时仍能保持50%左右的酶活力，这是作为洗涤剂用酶的基本条件。
3）碱性纤维素酶一般都为胞外酶。
4）最适温度为40-60℃，即使用自来不进行低温洗涤时，也能充分发挥其洗涤效果。
5）分子量在100KD左右。
6）等电点在4.4以下。
7）Hg+、Cu2+、和Co2+等离子对酶有不同作用的影响。
8）在羧甲基纤维素、非结晶领域的纤维素中发挥作用，但在结晶领域的纤维素中不发挥作用。
9）作为助洗剂而添加的螯合剂几乎不受阻遏。
10）不因洗涤成分表面活性剂而受到阻遏。
11）共存的蛋白酶可不受阻遏。总之它是一种理想的酶，几乎满足了洗涤用纤维素酶所需的所有重要条件。
五、碱性纤维素酶的酶学性质研究
不同来源的碱性纤维素酶在诸多方面有差异，如分子量、蛋白质结构、催化反应特性、热稳定性等。按照其分子量的大小，芽孢杆菌属产生的碱性纤维素酶可以分为两类，一类为低分子量的碱性纤维素酶，其相对分子量在24000-40000之间，另一类为高分子量的碱性纤维素酶，其相对分子量为80000-130000。1984年，掘越弘毅对嗜碱性芽孢杆菌NO-4产生的酶，经Serphadex G-100、羟基磷灰石柱纯化，从碱性范围有CMC酶活力的部分分离到两个组分，其分子量均为50KD，最适pH为10稳定pH范围为6-10稳定温度分别为60℃和80℃；1990年，Hiromi Okoshi 分离得到的中性芽胞杆菌KSM-522产生的酶，经分离纯化得到3个组分，最适pH分别为6，7-10和7-10，稳定温度分别为40℃，50℃和50℃。同年，Tadashi Yoshimatsu等对嗜碱性芽孢杆菌Ksm-635产的碱性纤维素酶经过纯化，得到两个组分，最适pH为9.5，稳定pH范围为6-11，最适温度为40℃，稳定温度范围为45℃-50℃。
1994年，山东大学微生物系的王东等对芽孢杆菌074生产的纤维素酶经分享纯化得到一个仅具有CMC酶活性的纯分子，最适反应温度为50℃，最适反应pH为7。1998年，中国科学院生物研究所的田新玉等对芽孢杆菌N6-27菌株产生的纤维素酶进行了纯化，酶在pH6-11范围内均稳定，最适反应温度为55℃，最适反应pH为8.5[8]。
表1：不同来源碱性纤维素酶的酶学性质
菌株号 稳定pH（存活50%以上） 最适反应温度（）
KSM-522 5.0-12.0 60;50
KSM-635 6.0-11.0 40
KSM-19 4.5-12.0 50
KSM-64 3.0-13.0 50
KSM-520 3.0-13.0 50
N-4 5.0-10.5 55
No.1139 5.0-12.0 40
074 4.0-12.0 50
N6-27 6.0-11.0 55
A04 5.0-12.0 40
六、碱性纤维素酶的去污机理
棉纤维的复杂结构使之吸水性好，但同时又带来一些缺点。因为污垢侵入以后与水分子结合形成胶状物而被封闭在纤维素分子结构中。洗涤剂的作用是降低污垢与纤维间的表面张力，使污垢增溶、乳化、分散，以至脱落达到去污的目的。
碱性纤维素酶可以在基本上不降低棉纤维牢固度的条件下，使污垢变得容易除去。棉纤维属于天然纤维素的一种，具有比木质纤维素更高的结晶度和聚合度，在同样条件下比木质纤维素更难分解。酸性纤维素和碱性纤维素从作用底物来看都属于纤维素类酶，但他们对底物所起的作用不同。酸性纤维素酶对木质纤维素的反应是一个糖化过程，在多种组分的协同作用下，能够得到更多的最终产物葡萄糖。而碱性纤维素酶则不同，他只有内切葡聚糖苷酶，不能发生酶组分间的协同效应，因此，碱性纤维素酶不像酸性纤维素酶那样使棉纤维发生比较多的分解破坏。碱性纤维素酶对棉纤维的反应，实际上主要与棉纤维中占10%左右的非结晶区的纤维素分子起作用，对结晶区纤维素水解活力很低，所以，洗涤剂中添加碱性纤维素酶并不会明显降低棉纤维的牢固度。为了说明碱性纤维素酶的去污机理，首先要弄清楚污垢与棉纤维的关系。棉纺织品的吸水性好，吸水性能不仅仅是纤维素分子上的大量OH基所致，还由棉纤维分子内部结构决定。棉纤维具有纤维素分子链形成的结构紧密的结晶区和占10%左右的结构松散、排列不规则的非结晶区形成的网状年轮状结构。这些结晶区的纤维素分子的水合，是棉纤维制品吸水性能好的主要原因。碱性纤维素酶还具有柔软功能,当主纤维上的绒毛和绒球被除去以后,主纤维变得光滑,而且也减少了微纤维的纠缠,因此可使纤维变得柔软。棉纤维的复杂结构使之吸水性好，但同时又来了一些缺点。因为污垢侵入以后与水分子结合形成胶状物而被封闭在纤维素分子结构中，造成用一般洗涤剂或者是一般加蛋自酶洗涤剂难以洗净，如果用碱性纤维素酶洗涤剂就很容易去掉。这是因为碱性纤维素酶，选择性地吸附在棉纤维的非结晶区的纤维素分子上，可以非水解性地崩解棉纤维的结构，使纤维膨胀而增加其表面积，使棉纤维结构膨胀。这样有利于包埋在纤维间的污垢脱落。同时，促进并提高了酶的催化功能区的催化活性。
七、碱性纤维素酶的应用
碱性纤维素酶主要应用于洗涤剂工业中，除此之外，在食品、化工、造纸、麻纺、环境保护等领域均有重要作用，这使得碱性纤维素酶的生产研究具有重大意义，所以对碱性纤维素酶的研究具有非常广泛的应用前景。近年来，国际上出现了利用微生物工程技术对纺织品进行处理，比较典型的是利用纤维素酶对纤维素纤维织物进行生物整理即酶降解整理。由于纤维素酶“清洁”植物纤维并使其膨胀，所以，经纤维素酶整理的织物蓬松、丰满、柔软、滑爽、布面清晰、悬垂性好、吸湿性强，并具有一定的“丝光”效果。故织物纤维素酶整理技术近年来一直被认为是“生物工程技术与纺织工程技术的完美结合”，纤维素酶的用量在0.5%—3%，即可达到满意的整理效果。
纤维素酶整理技术工艺简单，污染小，产品使用性能好，不需添置专用设备，不需大量的化工原料及昂贵的进口染整助剂，便可以生产出具有“烧毛、丝光、柔软”效果的产品。该技术可用于多种纺织品的整理，如针织内衣、外衣面料、牛仔服产品及麻类产品，经整理都能达到令人满意的效果。在纺织后整理工艺上，利用纤维素酶对亚麻、萱麻、牛仔服、灯芯绒、丝绸及混纺织品进行生物整理即酶降酶整理，可使强力适当下降的同时，表面变得光滑，织物获得蓬松，手感厚实柔软，还可以提高织物悬垂度、回弹性及列速度。
目前已成功地应用于洗涤剂商品的各种酶中，碱性纤维素酶是最晚开发的一种新型洗涤用酶。它不但具有优良的去污除垢的能力，而且经多次使用后，仍可使棉织物柔软、增艳，使织物纹理清晰，翻旧如新。织物经多次使用后，侵入棉单纤维结构内部的污垢越来越多，由于被纤维素分子与水形成的凝胶所封闭，这种污垢是很难去除的，从而导致了棉织物的发黄、泛黑和变硬。而纤维素酶能作用于棉纤维内部的非结晶区域，使上述凝胶结构有效地软化，使其中的污垢较容易地分离出来，从而可避免织物的发黄、泛黑和变硬。根据无锡轻工大学研究结果，在洗涤剂中加入少量碱性纤维素酶可使去污力明显提高。该碱性纤维素酶的适宜用量为20——30U/L洗涤液。应用碱性纤维素酶时，有必要进行适当的调整洗涤剂配方，以使酶与洗涤剂组分之间实现较好的协同作用，充分发挥出酶的去污能力。这种碱性纤维素酶经选粒后，在洗衣粉中密封储存6个月，酶活和稳定性较好，酶活在85%左右。
八、碱性纤维素酶研究的市场前景与存在问题
近年来，日本、美国、欧洲等国的加酶洗涤剂已占市场洗涤剂的80%-90%。我国是洗涤剂消费大国，据统计：1997年我国合成洗涤剂279.91万吨，1998年为280.34万吨：若以保守估计，其中的30%添加碱性纤维素酶，则酶年产量（按2%添加量计）达1.68万吨，所以国内市场前景十分乐观。但我国现有的加酶洗涤剂中， 以加碱性纤维素酶的洗涤剂所占比例还很小，未能达到产业化，这与洗涤用酶的预计用量有很大的差距，究其原因主要是酶的品种、活性及酶颗粒制粒制备技术与国外还有较大的差距，尤其在酶种上较单一，除碱性蛋白酶和脂肪酶外，其他酶种均处于研究阶段，而未投入实际应用，碱性纤维素酶的研制和应用也还处于初级阶段。
就目前国内有关碱性纤维素酶的研究水平来看：
1）酶活性还比较低，在国内还不能达到 工业化生产水平的要求：
2）对酶的纯化、酶学性质不完全学很少，特别是对酶在洗涤剂中的性质研究还很少；
3）对酶添加洗涤剂中的酶的作用机理的研究不够深入。这些都是阻碍碱性纤维素酶工业化生产应用的主要因素。
当前迫切需要解决的问题有：提高产酶水平，如对野生菌株通过现代物理化学方法进行诱变处理；通过现代基因工程的方法构建基因工程菌株，以提高产量；针对不同的菌株，优化其产酶工艺。其次是将碱性纤维素酶添加到洗涤剂中，进一步研究其在洗涤剂中的去污机理和洗涤剂对酶的影响，以提高酶在洗涤剂中的使用效率，并实现工业化。
参考文献
1.蒋惠亮，余晓斌，吕丽爽.洗涤剂用碱性纤维素酶应用性研究；日用化学工业，1996，5：l～4.
2.Gerrit B, Peterson B．Extra cellar enzyme system utilized by the fungus for the breakdown of cellulose．Eur J．Biochem，1985，146：301--308．
3.徐春厚，邵红，倪宏波.纤维素酶菌种的鉴定与筛选.中国饲料，2000，13：9～10。
4.孔舒，刘刚，刘森林等.ATTC碱性纤维素酶产生菌产酶特性的重新确定；深圳大学学报理工版，2005，22(3)：253---257.
5.赵新刚.洗涤剂用碱性纤维素酶及其产生菌的分离方法；微生物学通报，1999，26(1)：63-65.
6.郑卫，全文海，余晓斌.洗涤剂用碱性纤维素酶产生菌的菌种选育。南京师范大学报(自然科学舨)，1997，20(2)：69—72.
7.沈雪亮,夏黎明.芽孢杆菌产纤维素酶的研究.林产化学与工业,2002,22(3):54-58.
8.田新玉，王欣。碱性纤维素酶的产生条件和一般性质。微生物学通报，1997，24(4)：195-198。
