展【摘 要】发展我国的干酪产业,了干酪生产的现状,凝乳酶的结构和凝乳机理,凝乳酶活性的因素为pH值、温度、Ca2 +及其它因素,并介绍了国内凝乳酶代替品动物性凝乳酶、植物性凝乳酶、微生物性凝乳酶和基因工程凝乳酶的研发进展。
【关键词】凝乳酶；干酪；应用；代替品
0 前言
干酪营养,味道鲜美,贮存期长且种类繁多,是世界食品中的组成,素有“乳制品之王”之称。在干酪的生产工艺过程中,凝乳是干酪产率和品质的关键性工艺。凝乳酶是制造干酪的凝乳过程中起凝乳作用的关键性酶,凝乳酶对干酪的质构和特有风味的起着非常的作用[1] 。凝乳酶特指皱胃酶,它是从未断奶的小牛胃中的天门冬氨酸蛋白酶,其主要的生物学功能是有限剪切Phe105-Met106连接的κ-酪蛋白,牛乳凝结,被用于乳酪制造业,的酶制剂。
据资料报道,我国的干酪年产量为4万t左右,我国事业的发展和改革开放的,生活已大大,逐渐步入小康,对干酪的需求量将逐渐,预计到2015 年干酪年产量高达10 万t。,我国凝乳酶生产还没产业化,生产干酪需要的凝乳酶主要国外进口。此外,我国发展中,畜牧业还不很发达,单靠屠宰小牛而提取凝乳酶是干酪生产的需求,也不符合中共的社会,可持续发展观的要求。,凝乳酶的性质及其代用品的对我国干酪产业的发展有重大而深远的理论和现实意义[2] 。
1 凝乳酶的结构和作用
1. 1 凝乳酶的结构特征
牛凝乳酶是在小牛胃中以前体分泌的酸性蛋白酶。凝乳酶原分子量为40777道尔顿,共含365个氨基酸,在酸性条件下N 末端的42个氨基酸能够自我剪切掉,分子量为35 622道尔顿(含323个氨基酸)有活性的成熟凝乳酶。凝乳酶蛋白为肾形,它酸性蛋白酶家族的类二折叠对称的结构特点,与其它真核细胞天冬氨酸蛋白酶的同源性,变异范围在30%～60%之间。X线衍射,凝乳酶分子可分为由1～175氨基酸残基组成的N端区域和由176～323氨基酸残基组成的C端区域,两个区域之间是深沟状的活性部位[3] 。在N端区域和C端区域的分离裂沟底部两个天冬氨基酸活性位点, Asp - 34 和Asp - 216。氨基酸残基和水分子在活性位点的氢键网状结构以维持凝乳酶的类二折叠对称结构。二硫键Cys - 250和Cys - 283酶的活性有,将这两个二硫键羧基化或汞化,可使酶活性降低25%。
1. 2 凝乳酶的牛乳凝结作用
牛乳因凝乳酶而凝固,是酪蛋白而引起,牛乳中酪蛋白可分为αs - 酪蛋白、β - 酪蛋白和κ - 酪蛋白。在酪蛋白胶体中, 它们Ca2 +的敏感程度不同,αs - 酪蛋白易受Ca2 +的而沉淀；在室温并有Ca2 +时,β - 酪蛋白也沉淀；而κ - 酪蛋白本身稳定,且还抑制αs - 酪蛋白及β - 酪蛋白在Ca2 +下沉淀的保护作用。牛乳中酪蛋白酸钙- 磷酸钙复合体胶粒能稳定的胶体悬浮液状态,与κ - 酪蛋白的胶体保护作用是密切的[4] 。凝乳酶的凝固作用可分为2个阶段,κ - 酪蛋白受凝乳酶的作用生成副κ - 酪蛋白和糖巨肽,此过程属酶性,称为一次相；生成的副酪蛋白在Ca2 +的下引起凝固,本来对Ca2 +稳定性差的αs - 酪蛋白及β - 酪蛋白,丧失了酪蛋白的胶体保护作用,则一起凝固,此过程属非酶性,称为二次相。凝乳酶的凝结牛奶的功能,凝乳酶被地应用于食品乳酪的生产以利于牛奶的保存和乳制品的多样化。
,凝乳酶在血管增殖,治疗胃病(萎缩性胃炎,浅表性胃炎和慢性胃炎)等的功能和作用。
2 凝乳酶活性的因素
凝乳酶酶,它能酶活性的因素均能牛乳的凝固。包括牛乳的pH值、温度、底物浓度及乳中Ca2 +浓度等因素。
2. 1 pH值对凝乳酶活性的
凝乳酶属于酸性蛋白酶,又称天冬氨酸蛋白酶,这类酶的活性中心部位有两个天冬氨酸,这两个天冬氨酸的r - 羟基以离子化,以质子化。pH是对凝乳酶活性中心天冬氨酸的解离而酶的活性,从而凝乳反应阶段的反应进程。酸性蛋白酶的最适pH值在1. 5～5. 0。在干酪生产中,乳的pH值越低,凝乳速度越快[5] 。在酸性环境中凝乳酶活力最强, pH值低, 受凝乳酶凝固较短,凝乳较硬,其最佳pH值为4. 8左右；若超过中性,则凝乳酶很快失去活性。
2. 2 温度对凝乳酶活性的
牛乳受凝乳酶凝固, 在40～42℃ 时最快, 15℃或65℃则不凝固。有人作温度对凝乳酶凝固一次相及二次相的实验,其结果为一次相的温度系数与反应相同,在0 ～40℃范围内,温度每上升10℃,反应速度两倍；二次相温度系数,温度每升高1℃ ,反应速度就1. 3～1. 6倍。牛乳的温度凝结速度。但在干酪的生产中,乳温是在30～33℃。
2. 3 Ca2 +对凝乳酶活性的
Ca2+浓度的可以缩短凝乳,凝块的硬度。Ca2+对二次相有,对一次相亦有。在乳中添加Ca2 + ,Ca2+与H+的交换而降低pH值,间接了酶促反应的速率。Ca2+与酪蛋白胶束中的胶体磷酸钙离子交换,使κ - 酪蛋白胶束的表面电荷,使胶束间的空间斥力而彼此逐渐靠近,导
2. 4 其它因素的
底物浓度对酶促反应是有的。底物浓度的能酶促反应的速率。牛乳中蛋白质浓度对凝乳有的,凝乳反应阶段的缩短与体系中蛋白质浓度呈指数关系,凝乳剂的浓度相同的作用。负离子基团对凝乳酶的作用和乳的酶凝固抑制作用。经还, Na2 + 、Fe2 + 和EDTA 对凝乳酶活性有作用,而Mg2 + 、Cu2 +和Ba2 +对凝乳酶活性有抑制作用, K+对凝乳酶的活性的并不[8] 。
3 凝乳酶代替品的研发进展
小牛皱胃酶代替品应具备的特点:凝乳活性与蛋白分解活性之比；干酪制品的质地及风味可以被；贮藏期间性质稳定；对人体无毒副作用,来源,成本及价格较小牛皱胃酶竞争低等特点。在自然界中,几乎所蛋白分解酶在条件下都能使乳凝固。上述条件的限制,能够商品化的凝乳剂却为数极少。,国内范围涉及其它动物器官、高等植物及细菌、真菌。虽对皱胃酶代替品的研发尚初级阶段,不过阶段性的。
3. 1 动物性凝乳酶
人们在设法皱胃酶产量的也把焦点转向其它动物的胃蛋白酶,对猪、小羊等动物的胃蛋白酶的性质了。我国生猪年产量,猪胃蛋白酶易于获取,对其较多。刘文宗等加入不同的小牛皱胃酶、乳猪胃酶、育肥猪胃酶对干酪生产的,结果表明乳猪胃酶能以50%～66. 7%的比例替代小牛皱胃酶,育肥猪胃酶则用来替代。我国每年要屠宰的羔羊生产羔皮和裘皮。羔羊皱胃酶充足的原料资源。张富新等了不同因素对羔羊皱胃酶凝乳活性的。但羔羊皱胃酶凝乳性较低了它的使用价值[9,10] 。
3. 2 植物性凝乳酶
植物蛋白酶分布于植株的果实、叶、茎和根等部位,均可提取的蛋白酶。许多植物蛋白酶含有能使乳凝固的作用,如木瓜、无花果、波萝、南瓜和生姜等。人员用木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶应用于干酪的制作,在小牛皱胃酶和羔羊皱胃酶中添加20%木瓜蛋白酶,可较理想的。用胃蛋白酶和姜汁混合制作契达干酪,以0.2%胃蛋白酶和0. 2%姜汁混合可制得各个指标都的干酪。用生姜蛋白酶粗提物时, 加量5% ,在60℃保温, 4 min可凝乳[11,12] 。用姜汁和生姜蛋白酶粗提物试验,试验表明在的工艺条件下,凝乳完全,坚实而质地均匀,且无裂痕。凝乳块的表观特性和风味可以与皱胃酶产生的凝乳块相媲美。现可姜汁在程度上能够代替皱胃酶。
3. 3 微生物性凝乳酶
人们在寻找合适的微生物蛋白酶替代皱胃酶了的,从上世纪60 年代中期起,国外已有用微生物凝乳酶取代小牛凝乳酶制造干酪,用微生物凝乳酶生产的干酪已占世界干酪总产量的33. 3%。我国在20 世纪80 年代末也开始了微生物凝乳酶的。有人员从17株产凝乳性蛋白酶的霉菌中放射诱变选出1株高产菌株,并且了该菌的培养条件和分离工艺。也有人员分离筛选了1株产生凝乳性蛋白酶的微小毛霉,并对其酶学性质了。以凝乳酶产率和凝乳活力之比为指标从7株霉菌中筛选出1株微小毛霉,了其固体培养的最佳条件,并对其最佳凝乳条件及其酶学性质了。又Edam干酪的制造,其可或替代小牛皱胃酶。经若干人等的证明,少根根霉、卷枝毛霉、东京根霉、米曲霉和爪哇根霉等都能产生凝乳酶。刘振民和吴进菊等从酒药中分离出产生凝乳性蛋白酶的根霉,其与小牛皱胃酶和胃蛋白酶的差异及其在干酪生产上的差异,它完全可替代小牛皱胃酶[13,14] 。
3. 4 基因工程凝乳酶
基因工程凝乳酶是将牛凝乳酶基因克隆进合适载体并转入宿主中表达产生酶。凝乳酶是首个应用基因工程技术把小牛胃中的凝乳酶基因转移到细菌或真菌中生产的酶。基因工程生产的凝乳酶都有与天然牛凝乳酶相似的结构并且对κ - 酪蛋白有较的特异性[15] 。在1990年美国FDA已批准基因工程凝乳酶在乳酪生产中使用, FDA认可了3 种凝乳酶产品:克氏乳酸菌凝乳酶,黑曲霉菌凝乳酶,大肠杆菌K - 12凝乳酶。俄罗斯科学家培育出的转基因母绵羊所产的奶中含有凝乳酶,该凝乳酶与小牛皱胃酶的各相比均无差别。直至为止,我国所用的凝乳酶大依赖于进口。世界上已有美、英、意等19个能够生产基因工程凝乳酶,且大奶酪是由基因工程酶制得,我国却还跨入此列。,科研工作者需要奋发图强,为我国此项事业的发展而努力奋斗。
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