1、背景介绍
褶皱假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase 1 , LIP1)广泛应用于油脂、食品、化学制药等领域来催化脂肪水解、酯合成、转酯反应、手性拆分等反应，是目前工业应用最为广泛的脂肪酶之一。但是天然酶的性质往往不足以满足实际应用的需要,需要进一步用人工手段优化来提高其实用性。对LIP1而言，作为一种常温酶,热稳定性欠佳,最适温度为40℃,在50℃的半衰期不足一小时,并且在80℃时迅速失活。这一不足限制了其在工业高温环境下的实际应用。
上海交大冯雁课题组对LIP1进行了蛋白质工程改造，通过对关键位点的突变，提高了LIP1的热稳定性，同时改变了LIP1底物特异性，使其更倾向于反应短链底物。
2、基于氨基酸序列共义性分析的LIP1热稳定性改造
基于同源序列联配的氨基酸序列共义性可以用于鉴定同源蛋白家族中潜在的氨基酸或结构域，通过对这些候选残基或区域的替换可以更有目的性的改变特性。通过同源序列比对，研究者找到关键残基G414。他们发现414位点处于底物结合区域，并且在LIP1的六个同工酶序列中高度保守，多为丙氨酸（LIP5为苏氨酸），而LIP1序列的414位为一个柔性较大的G，认为该位点对LIP1的结构稳定性具有较大影响。通过对G414进行饱和突变，研究者发现G414A,G414M,G414H,G414W四个突变体均对LIP1热稳定性有不同程度提高，最好的突变体G414W将60℃半衰期延长了6.5倍，最适温度提高15℃。
对LIP1结构的分析发现，G414位于连接螺旋15和螺旋16的转角处，在底物酰基结合区形成一个柔性结构，在替换为更大的残基色氨酸之后，不仅减小了结构柔性，同时与周围的残基形成了额外的疏水相互作用，对LIP1的稳定性提高起到重要作用。
3、“意外收获”带来底物特异性改变
在对G414进行突变成功提高LIP1热稳定性的同时，以G414W为代表的大残基的替换显著的改变了LIP1底物特异性，使得其更倾向于反应短链的C2,C4,C6底物，而非野生型的C8,C10,C12中链底物。由于G414所处位置的特殊性：处于底物酰基结合区，结构分析认为底物特异性的变化是由更大残基带来的空间位阻作用导致。
4、小编解读
野生型LIP1为何没有在关键的414位与其他同工酶向相同的方向进化？小编认为，需要在LIP1底物酰基结合区引入更大的柔性以更适合于反应中链底物可能是这个问题的答案。另一方面我们也可以从中获得这样的启示：生物在自然进化中形成的特性总是朝着有利于自身生长/繁殖的方向，包括形成酶序列的多样性以行使不同功能。然而这与我们工业应用生物催化剂所需要的特性并不完全契合，这中间仍然有很大的空间可供我们去探索和开发。
