萜类化合物（Terpene）为自然界中数量最大的化合物，其存在于几乎所有生物体中并扮演重要的结构性（如细胞膜上的胆固醇）与功能性（如光合作用中所需的类胡萝卜素）的角色。此外，萜类也与病原菌致病性相关（如金黄色葡萄球菌的金黄色色素），许多萜类也被发现具有药用价值（如紫杉醇和青蒿素）。目前鉴定出的萜类化合物已超过七万种，功能与型态丰富多样，负责合成萜类架构的萜类合成酶为此领域最重要的研究热点。萜类基础架构皆由最小单位为五个碳的异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）与二甲基烯丙基（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），遵循“异戊二烯规则”以“头-碰-尾”、“头-碰-头”、“头-碰-中”、或者其他方式，组合成从十个到超过五千个碳单元（如橡胶）的各类化合物（图一）。根据萜类的碳支架构型以及酶的蛋白质结构，萜类合成酶可大致分为三大类：（1）全α-折叠的反式合成酶；（2）蝴蝶样折叠的顺式合成酶；（3）非典型萜类合成酶（非属全α-折叠和蝴蝶样折叠的结构）。系统性的了解这些萜类合成酶不同的催化机理，是非常重要的科学问题，也为将来重要萜类化合物的生物合成及代谢工程改造提供了重要的指导意义。
图一、萜类合成酶的分类
典型萜类为直链型，而典型的萜类合成酶遵循“异戊二烯原则”，将五个碳的IPP 依次添加到以五为倍数的碳链上（最小单位为 C5 的 DMAPP，以上有C10、C15、C20…）。近年来，科学界发现许多具有重要应用价值的不规则萜类化合物合成违反异戊二烯原则，郭瑞庭研究员课题组通过解析两个重要的蛋白质晶体结构（一是属于“头-碰-中”全α-折叠反式合成酶的MoeN5，另一个则属于“头-碰-中”蝴蝶样折叠顺式合成酶的熏衣草焦磷酸合成酶（LPPS））来说明此二类特殊的合成酶作用机理。
第一个是负责合成重要抗生素莫诺霉素（抗菌活性为万古霉素的10-1000倍, 使用至今少有抗药性报导）碳骨架的MoeN5。MoeN5为全α-螺旋折叠的同源二聚体，活性区具有两个底物结合域，结合10 个碳底物（GPP）的区域构造与其它萜类合成酶相同，结合15 个碳底物（FPG-sugar）的构造则完全不同，此区利用三个较大的疏水性氨基酸挤压C15，造成碳链尾端弯曲进而迫使C7-C8间的双键去攻击C10底物的双磷酸基团，最终形成特殊的C25产物（图二）。
图二、A. MoeN5晶体结构，为同源二聚体。B. 底物类似物电子云密度图。C. 推测的催化机理。
典型“头-碰-尾”全α-折叠反式合成酶的作用机理是由小底物 IPP 结合在 IPP site 去攻击大底物 FPP（FPP site）而产生产物。但 MoeN5 是催化更大底物（FPG-sugar）以头-碰-中的反应去攻击大底物 GPP，这种催化方式前所未见，是研究萜类合成酶领域十多年来的困惑之处。经由我们进行 MoeN5 结构解析之后，催化机理豁然开朗，证实了在自然演化情况下，GPP 结合在大底物结合位（FPP site）中，但 FPG-sugar 则结合在活性区外的区域，将欲进行催化的长链伸入 FPP site 中，即可进行此项特殊的催化反应，也因此 MoeN5即可在没有 IPP 结合位点的情况下，进行此项特别的催化反应（图三）。
图三、典型“头-碰-尾”全α-折叠反式合成酶和本文发表的 MoeN5 之不同的催化机理。
值得一提的，执行这个计划的初期遭遇到了关键的、同时也是晶体学家们最常遭遇到、最头痛的难题，MoeN5蛋白质晶体虽然很容易培养，但是晶体的分辨率却始终非常差（小于3.5 Å），无法用来观察活性区的细部结构。即使不断的筛选各种不同的养晶条件，也没有找到合适的高分辨率晶体。为了克服这个问题，郭瑞庭课题组尝试着将 MoeN5 连接上数种不同的小蛋白质以试着改变晶格堆叠。当时郭瑞庭研究员想起在读博士研究生时，之前实验室曾解析过来源于嗜热菌的 Sso7d、Sac7d 和 DNA的复合体结构，Sso7d 和 Sac7d 都是单体 DNA 结合蛋白，蛋白也有一定的大小（太小可能也改变不了晶格）。经过测试，最终来源于嗜热菌的 DNA 结合蛋白 Sso7d 与 MoeN5 的融合蛋白长出了高分辨率的晶体（~2.2 Å）。成功的关键在于 Sso7d 为小分子量的单体蛋白质（分子量<10 kDa），其存在改变了晶格堆叠，但却不改变主体蛋白质的性质，这个方法将可望大量应用于其他有类似问题的蛋白质结构解析上（图四）。
图四、A. Sso7d 和 DNA 的复合体结构。B. 和 MoeN5 融合表达，在晶体中增加了交互作用，长出了不同晶格的晶体。
所发表的背靠背第二篇文章是有关于熏衣草焦磷酸合成酶（Lavandulyl Diphosphate Synthase, LPPS）的研究成果。LPPS以”头-碰-中”的方式缩合两个DMAPP分子产生分枝型萜类产物，是一个前所未见的非典型萜类合成酶。透过分析晶体结构发现，LPPS为蝴蝶样折叠同源二聚体，其活性区具有两个小口袋，分别可容纳一个五个碳的底物。LPPS和底物类似物的复合体结构显示，只有两个DMAPP分子可以稳定存在于这两个口袋中，进而发生缩合反应。负责攻击第一个 DMAPP 双磷酸基团的 78 位组氨酸则是催化反应发生的关键位点（图五）。这份研究成果投稿至Angewandte Chemie International Edition后，两位审稿人一致给予非常高度的评价，并获选为 VIP“very important paper”，在无须任何修改的情况下以封面文章形式发表（图六）。
图五、LPPS 的晶体结构、底物结合情况及最终的产物（熏衣草醇碳骨架）。
图六、VIP重点封面文章。
中科院天津工生所张丽兰、陈纯琪博士和台湾中研院柯子平博士为 MoeN5 文章之共同第一作者。
天津科大联合培养硕士生刘美霞、中科院天津工生所陈纯琪博士和美国伊利诺伊大学陈璐为 LPPS 文章之共同第一作者。
文章链接：
1. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201511388/abstract
原文标题：Moenomycin Biosynthesis: Structure and Mechanism of Action of the Prenyltransferase MoeN5
2. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201600656/abstract
原文标题：Structure and Function of a “Head-to-Middle” Prenyltransferase: Lavandulyl Diphosphate Synthase
