关键词：萤火虫荧光素酶；生物发光；生物传感器；转基因菌株
Key Words：Firefly luciferase; Bioluminescence; Biosensor; Transgenic bacterial strain
Dubois在1990年的巴黎国际博览会上，曾向观众展示了一种能发光的细菌，在夜间，人们可用这6加仑培养液的发光细菌阅读报纸。这次展示激发了生物学家破解生物发光奥秘的广泛兴趣，开始了其它化学本质研究的现代历程。
早在1884年，Dubois就曾发现，将萤火虫研磨后荧光很快会消失，添加萤火虫尾部的新鲜提取物后又能重现荧光。此后，他证实提取物中存在荧光素和荧光素酶的相互作用，并推断生物发光至少涉及可氧化的有机化合物——荧光素；荧光素酶以及氧三种基本物质。1974年，Mcelroy等人开展了萤火虫荧光素酶(首称虫光素酶以区别细菌荧光素酶和水母的绿荧光蛋白，GFP)的物化性质研究。1956年，Green和Mceiroy获得了虫光素酶的结晶制剂。
上世纪70年代后，由于分子遗传学的快速发展，基因克隆技术的普遍应用，不仅在虫光素酶的活性部位、酶基因的结构、克隆、重组和转移及虫光素酶基因作为报道基因在分子生物学各分支学科研究中取得重要进展，还使虫光素酶的规模生产和国民经济相关领域的商业应用成为现实。
萤火虫以发射荧光的方式实现异性成虫之间的信息交流，以期在适宜的处所会合交配。为何在种类繁多的昆虫中只有萤火虫具备这种功能？这是由于其体内可以生成生物发光的各种物质。首先是一种能让化学物质(化学能)转变为光能的生物催化剂即虫光毒酶。以北美萤火虫为例，这是一种分子量为62KD，由551个氨基酸组成的单链特异蛋白质。萤火虫发射荧光的间歇时间和颜色(光波长)因品种而异，并受控于虫光素酶的化学结构。其次，是一种热稳定、易扩散、只存在于虫体发光器官的有机化合物，即荧光素，其结构式为C13H12N2S2O3，而且是一种细菌，萤火虫等生物能生物发光反应的共有底物。
此外，三磷酸腺苷(ATP)在萤火虫发光反应中具有关键作用。它既是所有生物能量的贮备形式，也是细胞代谢活动的能量来源，又是虫光素酶催化的发光反应中不可替代的专一性底物。研究表明，虫光素酶的真正底物是Mg++和ATP的复合物MgATP，而非游离状态的ATP。最后，氧分子(O2)是萤火虫发光不可残缺的物质，反应中适当的氧量与荧光亮度，持续时间密切相关。
总之，只要满足上述条件，不仅活体萤火虫，这些物质在离体条件下的试管中同样可以实现荧光反射。其反应式如下：
ATP+荧光素+O2
AMP+氧化荧光素+PPi+CO2+Hυ
AMP=一磷酸腺苷
PPi=焦磷酸
CO2=二氧化碳
Hυ=荧光
虫光素酶的用途
光敏和声敏电子元器件在自动控制方面的普遍应用(如公用门户，照明灯的自动启闭)已为人们所熟知。殊不知，虫光素酶在监测各种生命现象中同样有广泛的商业应用和潜在的开发前景。这是由于第一，所有生物(动、植物、微生物)都以ATP为生命活动的能量来源。其次，在有氧分子，ATP的条件下，虫光素酶催化荧光素氧化并发出便于灵敏检测的荧光。如果保持荧光素，氧和酶数量恒定，则荧光强度与ATP浓度呈正相关关系。据此，美国太空总署于上世纪60年代率先建立精度高达1/1012克的ATP检测技术，以期确定月球土壤或其它外太空样品是否存在痕迹量ATP，进而确定有无生命存在。
换句话说，借助荧光反应中ATP和荧光强度之间精确的数量关系就能快速而准确地监测生物体因生理状态、疾病、细胞数量变动等原因导致ATP量的变化，进而探明相关因果关系的实质。因此，虫光素酶被称为生物传感器(Biosensor)在诸多领域有着现实的和潜在的用途。可按应用范围归类如下：
虫光素酶的发酵生产
目前，向国内市场提供虫光素酶制剂的主要有Sigma, Promega和Roches三大生化试剂公司。为获得该制剂大多采用所谓的常规方法，即从大量养殖的萤火虫中取下尾部的发光部分，经连续脱水处理，超低温冷冻贮存备用。据资料每6000个萤火虫可获得发光部分约30克。且不说萤火虫的养殖是件繁杂费时的工作，从幼虫到发光成虫的周期大约三个月。此后，还须经过离心分离，硫胺分部，柱层析纯化等多个化学提取步骤，才能最终得到结晶制剂。
据国家知识产权局公布的发明专利，国内科技人员于90年代初从地方品种萤火虫中分离克隆到虫光素酶的编码基因，将其整合到高效分泌型载体pIN-III-OMPA3质粒中，然后转化到大肠杆菌SM101中，并从中筛选到遗传性能稳定的转虫光素酶基因的新型菌株。用该菌株通过微生物发酵便可获得其系列化指标与国际产品相同的制品。
与常规方法比较，利用基因工程菌发酵生产显然具有周期短、成本低、过程易于规范控制，以及由于发酵培养基成分简单，还由于虫光素酶基因受启动子LaczAD基因调控，具备易纯化和可诱导高产的特点。该项目的实施必将有力推进虫光素酶在国内的商业应用。www.cnenzyme.com
参考文献
1. Franklin R. Leach，ATP Determination with Firefly Luciferase, J. Appl. Biochem. 3,473-517(1981)
2. Zuejen Chen, Z. H. Jin. et. al④Production and Purification of Firefly Luciferase in Escherichia Coli, Biotechn, Techni, 10:89-93,(1996)
