酶固定化研究进展
刘秀伟 司 芳 郭 林 赵怡丽 樊 森
酶作为一种生物催化剂，因其具有高选择性、催化反应条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。此外，分离和提纯酶以及它们的一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本。在此条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展，并成为近几年酶工程研究的重点。
酶的固定化，即用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。依据酶的性质及用途，可分为吸附法、共价结合法、交联法、包埋法四种[1、2]。本文介绍这几种酶固定化技术的研究进展情况。
吸附法
吸附法是利用离子键、物理吸附等方法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。工艺简便及条件温和是其显著特点，其载体选择范围很大，涉及天然或合成的无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化，酶失活后可重新活化，载体可以再生[3]。国内科研人员选择不同的载体，进行了很多研究。
朱俊晨[4]等以多孔聚酯材料为载体，在黑曲菌丝体细胞与载体预培养的条件为pH值5.0，孢子浓度为105个/mL，固液比1/75时，菌丝的生长及吸附固定后产糖化酶效果较好，优于目前使用的多孔气泵石吸附法和海藻酸钠包埋法，为扩大糖化酶应用面、提高产率、降低成本提供了参考。
Mojovic L.等[5]将从Candida rugosa中提取的脂肪酶吸附固定在大孔共聚物载体上，在最优条件下最大吸附量为15.4mg/g ,酶固定效率为62%，动力学研究表明，脂肪酶是通过局部化学反应选择固定在载体上。作者在卵磷脂/异辛烷存在下，用此固定酶水解椰子油，酶活力为游离酶的70%，重复使用15次后，固定酶活性仍保持其最初活性的56%。
KAMATA 等[6]在恒温30℃、24h条件下的水溶液中，将胰蛋白酶和α—淀粉酶固定在珠状糖基蛋白上，实验过程无任何化学改性。所获得的固定化酶相对于固定在阴离子交换剂（器）或脱乙酰壳多糖上的酶，有较长的生命周期。
彭立凤[7]等研究了以CaCO3粉未为载体，吸附法固定脂肪酶的方法。该固定化酶很容易从反应体系中回收，重复使用5次，酶活力保留73.37%，用其催化棕榈油固相甘油解反应生成单甘酯，是一条“绿色”工艺，并减少了催化剂的消耗。
胡志国[8]等采用三元催化剂[Nd(P204)3—Al(i—Bu)3—BrCH2CH2Br]的顺序聚合法合成异戊二烯/1，2环氧己烷嵌段共聚物，用电化学吸附法将葡萄糖氧化酶固定在该共聚物中制成异戊二烯/1，2－环氧己烷嵌段共聚物葡萄糖氧化酶电极，该电极呈现典型的酶催化剂反应动力学特征，固定葡萄糖氧化酶的表观米氏常数Km为32.2mmol/L，酶催化反应的活化能力为37.2kJ/mol。
辛嘉英[9]等根据Candida rugosa脂肪酶（CRL）同工酶（CRLA和CRLB）在结构组成上的轻微差别，即CRLA的活性位点处疏水腔的开放程度较CRLB 大 ,CRLB上非共价结合有一些小分子酸性化合物，分别将其选择性地固定在疏水性不同的载体YWG—C6H5和 YWG—NH2上,通过一个简单易行的选择吸附步骤，同时达到了同工酶的分离纯化及固定化目的，由此提供了一种分离结构上相近的同工酶的方法，为CRL 同工酶的应用范围的扩大提供了方便。
吸附法也有许多不足，如酶量的选择全凭经验，pH 值、离子强度、温度、时间的选择对每一种酶和载体都不同，酶和载体之间结合力不强易导致催化活力的丧失和玷污反应产物等，因此，其应用受到限制。为提高其适用性能，一部分科研人员将此法与其它方法联用：
岳振峰[10]等以粉末状壳聚糖为载体，采用先吸附后交联的固定法，固定 α—葡萄糖氧化酶，酶活力为14300U，酶活力回收率为59.6%，效果较好，其酸碱稳定性及热稳定性好，可望为今后固定化酶法生产低聚麦芽糖的工业化提供参考。
曾鸣等[11]在进行固定菊粉酶水解菊芋提取液制备果糖的研究中，将内切菊粉酶和外切菊粉酶，用吸附和共价相结合进行，取得了较好的效果，对果糖、葡萄糖分离，果糖浓度可达95%。
交联法
交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内交联。根据使用条件和添加材料的不同，还能够产生不同物理性质的固定化酶。常用交联试剂有戊二醛、双重氮联苯胺—2，2，—二磺酸、1，5—二氟—2，4—二硝基苯、己二酰亚胺酸二甲酯等。
Quinn Z. K. 等[12]用戊二醛作交联剂，将由乳酸制得的 β—乳糖苷酶固定在石墨表面，石墨特有活性区域为17/100和25/100，固载量分别为1.8U/cm2和1.1U/cm2时，活性随酶固载量的增加而增加，固定酶的Km值约为游离酶的5倍，用此固定酶（浓度5%）水解乳糖，在37℃、3.5h以上，乳糖水解接近70%，实验证明，该固定酶有很好的贮存稳定性和可操作性。
交联剂一般价格昂贵，此法也很少单独使用，科研工作者一般都将其作为其它固定化方法的辅助手段，以达到更好的固定效果。
3 共价结合法
共价结合法是酶蛋白分子上功能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接，从而固定酶的方法。由于酶与载体间连接牢固，不易发生酶脱落，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。其常用载体包括天然高分子（纤维素、琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原及衍生物等）、合成高聚物（尼龙、多聚氨基酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等）和无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等）。
Wang SL.等[13]将由绿脓杆菌制备的壳多糖酶用共价结合法固定在聚合物载体羟丙甲基纤维素—乙酸—琥珀酸盐上，该载体在pH值5.5以上是可溶性的，pH值低于4.5时是不溶性物质，用粗制酶溶液固定，有效固定酶达99%。天然壳多糖酶激活能量为41.38kJ/(g.mol)，而固定酶激活能量为24.91kJ/(g.mol)，固定最适pH值为8，温度50℃，半衰期由游离酶的9天提高至现在的13天，酶重复使用10次后，酶活力仍保持70%.
AM Dessouki等[14]将支链淀粉酶用共价结合法分别固定在由环氧氯丙烷活化的琼脂糖和由环氧氯丙烷活化的三氯三嗪—酪蛋白上，并合成共聚物丙烯酸盐—丙烯酸。使用10次仅有轻微损失（约20%）。使用0.5～10Mrad γ射线作一次照射实验，游离酶在5Mrad时，活性完全丢失，而固定酶在5Mrad时仍对射线有很高抵抗能力。
ZAITA 等[15]将由黑曲霉制得的胞外内切菊粉酶共价固定在溴乙酰纤维素（BAC）、纤维素碳酸盐（CC）和溴化氰活化的琼脂糖（CAS）上，并通过对氯苯甲酸汞、Fe3+、Mn2+激发这三种固定酶以提高其抵抗失活的能力。研究表明，用CAS固定酶水解菊粉，最适温度显著提高（由45℃升至60℃）；BAC固定内切菊粉酶在酸性环境稳定性降低，而在碱性环境中稳定性有所升高；CC固定内切菊粉酶则在酸性环境中稳定性较高。BAC固定内切菊粉酶Km值降低，而CAS固定内切菊粉酶Km值升高。
K.H Jang等[16]将Zymononas流动果聚糖蔗糖酶用离子结合法固定在羟（基）磷灰石表面，固定最适条件为pH值6.0，时间4h，固载量20U/g基体。这种固定酶用于或洗涤剂时，其生物活性近似于天然酶。
共价结合法载体的活化或固定化操作较复杂，要严格控制条件才能使固定化酶的活力高。蛋白质通过什么基团参加共价连接，载体的物理和化学性质等对固定化酶都有影响。因此，人们常常将其与交联法联用。
安小宁[17]等采用壳聚糖包埋磁粉，经戊二醛修饰、环氧氯丙烷交联制得高磁性壳聚糖微粒，此微粒共价结合卵清粘蛋白得到磁性亲和吸附剂，应用于胰蛋白酶的亲和纯化，纯化倍数为1.56，活性回收率为41.2％。
郑连英[18]采用天然高分子聚合物几丁质作载体，以戊二醛为交联剂，通过化学交联反应将纤维素酶固定在几丁质上，在戊二醛浓度1.25%，pH值4.0时固定纤维素酶，该固定化酶的半衰期为60天。用于降解壳聚糖，产物平均分子量2900，降解效果明显。
黄家贤[19]等通过反相悬浮聚合，以乙烯撑碳酸酯为反应性单体，亲水性N，N’―亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，分别选用N－乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸－β－羟乙酯两种亲水性单体为合成酶载体的成分，首次以二甲基甲酰胺和线型高分子聚乙二醇400为复合致孔剂合成了两种性能优越的，可快速且可保持酶活力的固载胰蛋白酶的大孔型交联高分子酶载体，其以σ共价键形成的固定化酶和以纯物理吸附形式吸附的酶同时存在于骨架之中，经六次使用后，纯物理吸附酶近乎定量脱落，而占85％的σ共价键结合酶则活力不变。利用纯σ共价键结合于高分子骨架的酶不易脱落这一特性，可使固定化酶的脱落催化过程简化，从而可将这种高分子酶载体用于临床医学中属于多肽类毒素（分子量2000左右）的排除。
包埋法
这是一种不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和，很少改变酶 结构的固定化方法，其基本原理是单体和酶 溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的网格中。固定化时保护剂和稳定剂的存在不影响酶 的包埋产率。这种酶包埋在高聚物内的方法对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。
包埋法又分为凝胶包埋法和微囊化法[1]。凝胶包埋法是将个别酶分子包在高聚物格子中，可以将块状聚合形成的凝胶切成小块，也可以直接包埋在珠状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强度提高10倍，并改进酶的脱落情况。微囊化法是将酶溶液或悬浮液包裹在膜内，膜既能使酶存在于类似细胞内的环境中，又阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接触。小分子底物则能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来[3]。此法包埋的酶量很多，在医学上具有很大的应用可能性，因此越来越受到人们的注意。
ELENA A.[20]采用一种比较温柔的方法一步将细胞或酶包埋固定在大孔复合聚（N—乙烯基己内酰胺）—藻酸钙（PVCL—CaAlg）水凝胶上，并研究了固定酶的热稳定性和贮存稳定性以及酶在水/有机介质中的性能。研究表明，复合PVCL—CaAlg水凝胶固定蛋白（水解）酶、胰蛋白酶、α—胰凝乳蛋白酶、羧（基）肽酶、凝血酶都非常成功，热稳定性实验表明，酶在65—80℃仍可使用，而天然酶在50—55℃时就会完全失活。
钱军民[21]以羟乙基纤维素(HEC)和四甲氧基硅烷(TMOS)为原料，利用溶胶—凝胶技术，通过TMOS水解和缩聚反应制得了HEC/SiO2凝胶复合物，并用此凝胶复合物对葡萄糖化酶(GOD)进行包埋固定化，在给酶量21mg，磷酸盐缓冲液pH 6.5，温度32℃条件下，固定化GOD的活力可达1000μmol/(g.min)（载体质量以干态为基准）以上，约为游离GOD活力的50%，其反应稳定性、贮存稳定性均有提高，分离后重复使用12次，活力仅有稍许下降。
姜忠义等[22]选用正硅酸乙酯为前驱体,代替目前生物分子包埋中常用的正硅酸甲酯（正硅酸乙酯价廉易得，但反应活性低），通过改变反应物配比、催化剂用量及其他反应条件（如采用旋涡混合法代替传统超声波促进正硅酸乙酯的溶解，加缓冲溶液，加碱调pH值等），摸索出了最为适宜的凝胶化条件，制备了较好的包埋基质。
包埋法与交联法联用，也是科研人员目前研究的热点：
沈立新[23]等通过对比，选择卡拉胶为包埋载体，将其溶于去离子水，与菌体以一定比例混匀，铺成1～2mm厚的膜，凝固后切粒，并以戊二醛交联，制成载体包埋E.coli BL21(pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽(GSH)，优化条件下罐式反应器中GSH产量为0.84g/L，操作稳定性较好，如果延迟加入甘氨酸，将GSH的合成分阶段进行，GSH产率可提高17.5%。
王康[24]研究了壳聚糖—海藻酸固定化酶水解橄榄油的特性，壳聚糖（聚阳离子）与海藻酸（聚阴离子）通过静电相互作用，在海藻酸微囊表面复合一层聚电解质半透膜，可提高微囊的稳定性和载酶量，但增加了对底物扩散的限制，使初始酶活降低。
陈雄[25]采用明胶和海藻酸钠聚合，并加入戊二醛作交联剂，包埋制备固定化糖化酶，结果表明，固定化酶米氏常数Km为12.3g/L，游离酶米氏常数Km为7.5g/L，固定化酶最适温度70℃，重复使用10次活性未见下降。
载体改性及新型载体的选用
5.1 载体改性
随着生物技术的发展，酶在生物医学和手性化合物的合成中得到广泛应用，但这两方面对酶 的定向性有很高的要求，一般载体固定酶很难达到使用要求，科研人员通过研究，以磁性高分子微球为载体来固定酶，从而为酶在这方面的应用奠定了基础。
磁性高分子微球是指内部含有磁性金属或金属氧化物（如铁、钴、镍及其氧化物）的超细粉未，而具有磁响应性的高分子微球。用其作固定酶载体有以下优点：1.固定化酶从反应体系中分离和回收简便，对于双酶体系，当一种酶失活时，可以用磁性材料再固载另一种酶，回收后反复使用。2.磁性载体固定化酶放入磁场稳定的流动床反应器中，可以减少反应体系中的操作，适合大规模连续化生产。3.利用外部磁场可以控制磁性材料固定酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌，提高固定化酶的催化效率。主要合成方法是利用天然高分子材料包埋磁性微粒，或在磁流体存在下进行聚合反应，均可得到纳米级的磁性微球[26]。
任广智等[27]首先用化学共沉淀法得到磁性壳聚糖微球，结果表明，磁流体中四氧化三铁以水化物的状态存在，其含量为2.04%，平均粒径为0.2～0.4μm左右。该微球具有良好的磁响应性，在外加磁场下可被快速从溶液中分离出来。而用环氧氯丙烷活化的磁性壳聚糖作载体，对脲酶进行固定化，在25℃时，对脲酶的固定化在2h就达到了最大值。
王强斌[28]将具有超顺磁性材料的纳米磁流体分散于聚丙烯腈的N,N—二甲基甲酰胺溶液中，混合均匀后，利用喷雾干燥法制备了具有超顺磁性的聚丙烯腈微球，粒度分布在1.0～1.5μm，磁含量约15%。
董聿生[29]采用反相悬浮包埋技术合成了粒径在43～295μm之间的磁性琼脂糖微球，再经环氧氯丙烷活化后，分别键合6—氨基己酸、氨基乙酸和乙二胺，用水溶性碳二亚胺[１－乙基－３－（３－二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）]为缩合剂，分别偶联对氨基苯甲脒，L—精氨酸甲酯和胍基己酸，制备了3种磁性亲和吸附剂 ，并用于尿激酶粗品的分离纯化。结果表明，胍基是纯化尿激酶的优良导体。该载体与以磁性葡聚糖微球为基质的吸附剂相比，前者对尿激酶的纯化效果更好。
邱广亮[30]应用乳化复合技术对琼脂糖进行改性，制备出均匀稳定的磁性琼脂糖复合微球，并以其为载体，采用物理吸附法，制备出磁性固定化纤维素酶(MIE)， MIE既可稳定分散于水相中，又可借助外部磁场方便简单地分离回收和磁性导向，为该酶在工业、医药、食品、纺织品等方面的应用提供了新途径。
4.2 新型载体
设计新型载体和运用当代高新技术，并将二者有机结合起来，是固定化酶研究的最新动向。科研人员发现，导电聚合物作为酶固定化载体时可用于酶电极类生物传感器的制备，当光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶时，条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。N-异丙基丙烯酰胺及其衍生物共聚可得到温敏性水凝胶载体，用于固定嗜热菌蛋白酶时可实现均相催化和异相分离的统一[2]。
Hao YU 等[31]通过反应基团氮丙烯氧基琥珀酰亚胺（NAS）将胰蛋白酶共价偶合到热敏聚合物N—异丙基丙烯酰胺（pNIPAAm）上，方法是将NAS混入聚合物和酶中，让其各自固定。偶合到此预成型共聚体NIPAAm-NAS（共轭Ⅰ）的酶比偶合到其它方法制备的NIPAAm-NAS（共轭Ⅱ）上的酶保留了更高的活性，共轭胰蛋白酶比游离胰蛋白酶更耐热处理。
Amritkar等[32]提议一种新形式，将脂肪酶共价固定在可逆溶胶共聚物上，与固定在多孔固体载体相比，其扩散容易，有利于酶的重新使用。胰蛋白酶固定在Eudragit上在水中溶解显示可逆性，pH值低于5.0时为水溶液，pH高于5.5时呈凝胶状，Eudragit—脂肪酶 在水解橄榄油时活力是游离酶的4倍。
Cicek H.等[33]研究了热敏性共聚物载体异丙烯酰胺/羟乙基异丁酸对α胰乳蛋白酶的包埋，发现热敏性凝胶对温度作出响应时，凝胶形状呈线性变化，负载量大的固定化酶表观活力较大，但单位负载量的固定化酶活却有所下降。酶反复使用30次后，酶活未见明显下降。
Suye S. 等[34]将葡萄糖氧化酶固定在改性聚碳酸酯膜上（膜预先用氨基甲酸乙酯和L—赖氨酸改性，并用戊二醛活化），这种固定化酶的热稳定性和pH稳定性大大优于天然酶。这种载有酶的膜常用于葡萄糖传感器。
6 结束语
综上所述，四种酶固定化方法各有所长，其种包埋法是相对较好的一种方法，但几种方法联用，往往效果更好。无论采用何种方法，固定化酶的稳定性是首要考虑的因素。酶、载体及试剂的费用、操作难易等与工业化有关的因素也必须考虑。科研人员在研究时，应尽量选用价格低廉、易得的载体和试剂，载体最好是已在其他工业生产中大量使用的材料，同时也要考虑其应用时的安全性。
目前，酶固定化技术已在食品工业、精细化学品工业、医药特别是手性化合物等行业得到广泛应用，在废水处理方面也取得了一定进展。用酶技术生产化工产品，条件温和，无三废产生，随着人类对环保的日益关注，酶的应用会更受关注，如何充分利用天然高分子载体，对其改性，或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定酶，必定会成为研究的热点。同时，开发新型、高效固定化酶反应器，进一步提高转化率和生产能力，也是未来研究的重点。而固定化酶在各行业的应用研究也必将推动酶固定化技术的进一步发展。
