糖苷酶及其抑制剂的研究

摘要：糖苷酶是生命体正常运转的关键性酶，糖苷酶抑制剂可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，因此对一些糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值。本文研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶以及蔗糖酶的抑制剂。重点研究了β－半乳糖苷酶的分子结构和活性基团，并从结构出发筛选其抑制剂，发现此酶的抑制剂种类较少且抑制活性较低。本实验采用混合交叉筛选法筛选了多种金属离子和氨基酸对β－半乳糖苷酶的抑制作用，同时也筛选了天然产物和合成化合物。

关键词：糖苷酶 β－半乳糖苷酶 β－葡萄糖苷酶 蔗糖酶 抑制剂的筛选 混合交叉法

1、前言

糖苷酶和糖基转移酶不仅参与了体内碳水化合物的消化，而且是糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪酶，它对糖蛋白中寡糖链的形成极为重要；糖链的组成与结构是糖蛋白特异生物功能的识别部位，因此糖苷酶活性对糖蛋白生物合成有关键作用，而后者又涉及到免疫反应、神经细胞的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌的感染. 因此, 糖苷酶不仅是生命体正常运转的关键性酶,同时又是许多疾病的相关酶. 与病毒感染、癌症及一系列新陈代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病有关。由于糖苷酶重要的生物学意义，糖苷酶抑制剂的研究也引起了人们的极大兴趣。

糖苷酶抑制剂即是可抑制糖苷酶的活性，阻断碳水化合物的分解，抑制淀粉、麦芽糖、蔗糖转变成单糖；影响糖脂、糖蛋白生物合成中寡糖链的修剪；所以糖苷酶抑制剂不但对一些糖代谢紊乱性疾病如糖尿病、肥胖病等有临床应用价值[1] ，而且可作为抗AIDS病毒[2]、抗鼠白血病毒[3]的潜在治疗试剂。

本论文重点研究了糖苷酶中的β－半乳糖苷酶

β－半乳糖苷酶（β－galactosidase）又称β－D－半乳糖苷水解酶，（β－D－galactosid- -e galacto-hydrolase ,EC.3.2.1.23）,商品名为乳糖酶（Lactase），它广泛存在于豆类及其他各种动植物体内和微生物中。它能够催化β－半乳糖苷化合物中的β－半乳糖苷键发生水解，还具有转半乳糖苷的作用。由于它具有糖苷键结构特异性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂[4,5]，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基.引起血型转化等生理功能[6,7]而受到人们广泛关注，成为生物化学和酶催化化学的重要研究课题。

β－半乳糖苷酶的应用有着长远的历史，最初在食品工业中用来降解乳糖含量以满足乳糖不适症患者的需要，然而随着生物技术的发展，它越来越应用于基因工程、蛋白质工程和疾病诊断方面。

将β - 半乳糖苷酶与人体胞外淀粉状蛋白前体融合形成融合蛋白, 可作为Alzheimer 病的免疫源, 并进一步制备其单克隆抗体[8]。还有报道将β - 半乳糖苷酶作为一种辅蛋白, 用作猫白血病毒gp70 的疫苗[9]。

在诊断方面, 将抗菌性HIV 病毒基因与β - 半乳糖苷酶基因LacZ重组后作为定量HIV利用循环的早期抑制作用, 并预测化合物抗HIV的活性工具。同时，近年来β－半乳糖苷酶基因被越来越频繁的用于转基因治疗方面，β－半乳糖苷酶基因作为报告基因，通过检测β－半乳糖苷酶的表达情况，研究转基因治疗[10]。

在环境检测方面, 大肠杆菌的β - 半乳糖苷酶活性检测可快速分析浴场和渔场地区水体受排泄物污染程度。

由于β－半乳糖苷酶的广泛应用和重要的临床价值，人们对此酶的基因进行了深入的研究，通过众多学者的努力，目前β－半乳糖苷酶基因库已基本建立并将日趋完善。但是，对于此酶的抑制剂研究还很少，目前文献中所报道的研究酶和抑制剂相互作用的方法，基本上是用单一的竞争性或非竞争性抑制剂与酶作用，通过动力学研究或用现代仪器分析技术进行表征，获得有关

酶的结构或催化机制的信息。本实验就从酶的结构出发，探讨研究并大量筛选其抑制剂。

Overall views of the β-galactosidase active site

Figure1. Stereoview of a surface representation of the tetramer in which each subunit

is shown in a different color. Two lactose molecules (shown in white) are shown binding in the active site pockets. The deepest parts of the active sites are not visible in the figure. The other two active sites are on the “back” side of the tetramer.

Figure2. Closer stereoview of a single active site. Protein atoms are colored by domain with domain 1 in blue, domain 2 in cyan, domain 3 in yellow, and domain 5 in red (there are no atoms from domain 4). Solvent molecules and metals are in white. The yellow balls are metal ligands which are protein atoms. The semitransparent surface was calculated using protein atoms plus solvent atoms with B < 25 Å2. Two ligands are shown: lactose (green) binds in the “shallow” mode while galactono- lactone (red) binds in the “deeper” mode.

通过对酶的分子结构和活性基团的分析，发现其蛋白质原子中有金属配体，因此研究了金属离子和氨基酸对此酶的抑制活性。

2.实验部分

1、混合交叉法筛选金属离子和氨基酸等生物小分子

Table1.The cooperation effect of Amino acids and Metals

从上表可以看出，金属离子和氨基酸有协同抑制活性，但抑制效果较小，当单独的金属离子有激活作用时（如Mg），协同多种氨基酸反而表现有抑制活性，可以初步判断比较好的是Co和Ala的协同效果。

2、天然产物化合物的筛选

包括黄酮类、 异黄酮类 、染料木素及其铜、锌、硼络合物 、酰化物、多酚类 、联苯类等一系列化合物。

Table2. The The inhibition of nature compound

单位：mM

3、合成化合物的筛选

通过筛选发现，奎啉类衍生物对β－半乳糖苷酶具有一定的抑制活性。

Table3. The inhibition of synthesis compounds 单位：mM

3.结果与讨论

通过上述多种金属离子、氨基酸以及天然产物和合成化合物的大量筛选，我们得出一定的酶与抑制剂的构效关系讨论：

1、 二环或三环多酚类化合物对该酶有抑制效果

2、 三环类黄酮化合物的C环若为刚性的苯环则没有抑制效果。

3、 喹啉衍生物中取代基中含有较大原子的化合物抑制效果更好

4、 喹啉衍生物中取代基含有氨基支链的抑制效果较好

在研究β－半乳糖苷酶的同时也研究了糖苷酶中的β－葡萄糖苷酶和α－蔗糖酶，对它们的抑制剂也进行了筛选，发现下面三种化合物同时对β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶有抑制活性。

对三种糖苷酶抑制剂的筛选我们得出以下结论：

1.β－半乳糖苷酶 、 β－葡萄糖苷酶、 α－蔗糖酶的潜在抑制剂的高效抑制较少且抑制活性较低，这与三种酶功能的多样性有关。

2.金属离子与天然产物中的活性成分以及氨基酸等生物小分子具有协同抑制作用。

3.β－糖苷酶类的抑制剂具有一定共通性

4.酶的抑制剂具有专一性，如a－葡萄糖苷酶抑制剂、醛糖还原酶抑制剂对三种酶基本没有抑制效果

通过对实验结果的讨论我们将进一步从构效关系上研究和探讨糖苷酶的抑制剂，为药物开发以及疾病的诊断起到积极的指导意义。

致 谢

本论文的研究工作得到了马林老师的悉心指导，在实验中得到了王渝芳师姐的耐心帮助，她教给了我许多实验的方法和技巧，在此，向他们表示衷心的感谢。

本研究项目得到了第四届化学院创新化学研究基金的资助，在此深表谢意。

参 考 文 献

[1]Lembscke B,Digestion,1985 5,31:120

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[3] Sunkara P S,Biochem Biophys Res Commun,1987,148:206

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[6]Mueller T J ,LiY T,Morrison M J.Biol Chem,1979,254:5458

[7]Fukuda M M,Fukuda M,HakomeriS I J,Biol Chem.1979,254:5458

[8]Romanos M A ,Clare J J, Beesley K M,et al. Recombinant Bordetella pertusis pertactin from the yeast Pichia pastonis: high-level production and immunological properties[J],Vaccine,1991,9:901-906.

[9]Vijay Chiruvolu,James M Cregg,Michael M Meagher,Recombinant protein production in an alcohol oxidase-defective strain of Pichia pastonis in fedbatch fermentations[J],Enzyme Microb,Technol,1997,21:277-283.

[10] Zahn-Zabal M,Kobr M,Girod P A,et al. Development of stable cell lines for production er regulated expression using matrix attachment regions.J Biotechnol,2001,87(1):29-42.

A study of glycosidase and its inhibitors

Liu Rong-rong ,Ma lin*

(School of Chemistry and Chemistry Engineering, Zhongshan University, Guangzhou 510275)

Abstract Glycosidase is a series of the important enzymes in organism.The inhibitors of glycosidase can inhibit the activity of the glycosidase and the hydrolysis of the carbohydrate ,so they have many applications in clinical and practical fields.The article researches the β－galactosidase , β－glucosidase and sucrase.From filtrating the inhibitors of the β－galactosidase based on the molecular structures and the active sites,we find that the species of the inhibitors are few and the activity is low.The article mainly use the crossover of mixture to filtrate the amino acids and the metal ions.They have cooperation effect to inhibit the β－galactosidase.The natural compounds and synthetic compounds also have the inhibition on the β－galactosidase.

Key words β－galactosidase β－glucosidase sucrase filtrating inhibitorcrossover of mixture