李剑梅 修翠娟 李 莉 王振丽
大豆异黄酮可调控动物机体养分代谢，改善饲料利用率，可改善动物产品的品质，并有抗氧化作用，提高动物免疫功能和生产机能。因此，大豆异黄酮在畜禽营养中的作用越来越受到关注。但是大豆异黄酮主要以结合型的糖苷（glucosides）形式存在，从大豆中提取的大豆异黄酮中游离型的苷元占总量的2％～3%，结合型的糖苷占总量的97％～98%。研究发现：结合型的糖苷不具有最佳的生理活性状态，只有大豆异黄酮糖苷被水解脱去糖基转化成游离型的苷元形式才能被动物体吸收，发挥生理调节作用。β-葡萄糖苷酶能使生物活性因子大豆异黄酮苷等生物苷类物质脱去糖基，变成分子量较小的高生物活性苷元，进而提高生物利用率。β-葡萄糖苷酶（bata-Glucosidase）系统名称为β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶（bata-D-glucoside glucohydrolase;EC.3.2.1.21），它是纤维素酶系中的一个组分，主要作用于β-1，4糖苷键，还能作用于β-1，1、1，2、1，3、1，6糖苷键。目前市售商品β-葡萄糖苷酶主要是从酵母、苦杏仁等植物种子中分离纯化而获得的，主要应用于食品、饲料工业中，如青梅脱苦、降解纤维素等。微生物生长速度快，能分泌多种胞外酶，并且成本低廉，是β-葡萄糖苷酶的重要来源。扬树林等（2006）用微生物发酵法和DEAE-SephadexG100离子交换法从绿色木酶发酵物中分离纯化出一种分子量为64.7 kD的β-葡萄糖苷酶，并对酶学性质进行了初步的研究。本文利用从大豆发酵物中筛选出的一株β-葡萄糖苷酶高产菌株进行液体发酵，得到β-葡萄糖苷酶粗酶液，进行相关的酶学性质研究，以便于该酶的进一步开发利用，同时为大豆异黄酮微生物酶转化工艺的研究提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基
发酵培养基组成为蛋白胨0.2％、水杨苷0.05％、麸皮2％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.1％、VC 0.1％。
1.1.2 主要试剂
DEAE-SephadexA50(Sigma公司生产)、标准β-葡萄糖苷酶(Sigma公司生产，100 U)、标准分子量蛋白(上海生物化学研究所提供)、十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂为国产电泳纯，其它试剂为国产分析纯。
1.1.3 主要仪器
层析柱、TH-梯度混合器、BSZ-100自动收集器、HL-2恒流泵(上海沪西分析仪器厂生产)、电泳仪(北京六一仪器厂生产)、723分光光度计(上海精密仪器厂生产)、台式低温高速离心机(Sigma公司生产)，其它仪器为实验室常规设备。
1.2 方法
1.2.1 菌种的培养
将发酵培养基组分用蒸馏水溶解并定容至1 000 ml，分装到500 ml三角瓶中，装量为80 ml；121 ℃灭菌20 min，无菌操作接入42 h的种子培养液；在温度为30 ℃，摇床转数160 r/min条件下培养72 h，合并发酵液，离心(1 000 r/min)除菌，收集上清液即为β-葡萄糖苷酶粗酶液。
1.2.2 β-葡萄糖苷酶活性测定
1.2.2.1 葡萄糖标准曲线的制作
采用分光光度法。取8只带有刻度的比色管，精密吸取葡萄糖标准液（1 mg/ml）各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ml于比色管中，再用蒸馏水补足至2 ml，分别加入1.5 ml DNS试液，置于沸水浴5 min，用蒸馏水定容至10 ml，于540 nm处比色，绘制标准曲线，见图1。曲线方程为Y=2.281 19X-0.001 83，r=0.997 9。
1.2.2.2 样品中β-葡萄糖苷酶酶活的测定
取4只10 ml的比色管，其中1只为对照管，3只为样品管于每只比色管中分别加入0.5%的水杨苷0.5 ml后，在对照管中再加入DNS试液1 ml；然后将4只比色管在50 ℃水浴中放置5 min；再向每只比色管中分别加入酶液0.5 ml；将4只比色管放在50 ℃环境中水浴30 min后，向样品管加入DNS试液1 ml；将4只比色管沸水浴5 min后，分别用蒸馏水定溶至10 ml，于540 nm波长测定吸光度值。酶活单位规定为每小时生成1 μmol/ml的葡萄糖为一个酶活单位(U)。
1.2.3 β-葡萄糖苷酶分子量的测定
经过摇床发酵培养，得到发酵液，离心收集上清液，缓慢加入硫酸铵进行分步盐析，相对饱和度为浓度为35％～75%；离心收集沉淀物，用pH值4.50柠檬酸缓冲液(0.1 mol/l)溶解，经透析后，依次用DEAE-SephadexA50离子交换柱吸附，再用0.1～0.8 mol/l氯化钠溶液梯度洗脱步骤进行分离纯化后，用SDS-PAGE电泳以确定分子量。
1.2.4 粗酶最适作用温度
酶与底物反应30 min,在30、40、45、50、55、60、65、70 ℃条件下分别测定β-葡萄糖苷酶酶活。设最高酶活为100%。
1.2.5 粗酶最适作用pH值
用不同pH值的柠檬酸缓冲液（0.1 mol/l）调节反应体系中的pH值，在最适反应温度条件下，分别在pH值3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7环境下测定β-葡萄糖苷酶酶活。设最高酶活为100%。
1.2.6 粗酶的热稳定性实验
将粗酶液分别放在30、40、50、60、70 ℃条件下保温6 h，每1 h测定一次β-葡萄糖苷酶酶活。未经过保温处理的为对照组，活性设为100%。
1.2.7 金属离子对粗酶酶活的影响
在反应体系中添加一定浓度的金属离子至终浓度为0.01 mol/l，考察其对β-葡萄糖苷酶酶活的影响。以未加入金属离子的酶液为对照组，活性设为100%。
1.2.8 底物浓度对粗酶反应速度的影响及热学动力学参数Km和Vmax的测定
用pH值4.5的柠檬酸缓冲液(0.1 mol/l)配置0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%的水杨苷为底物，测定与不同浓度底物反应时的β-葡萄糖苷酶酶活，考察不同底物浓度对酶反应速度的影响，同时采用双倒数作图法(Lineweaver-Burk)推导出Km和Vmax值。
2 结果与分析
2.1 β-葡萄糖苷酶分子量的测定
粗酶液经过35％～75%分步盐析和用DEAE-SephadexA50离子交换柱吸附、梯度洗脱等步骤分离纯化后，当氯化钠洗脱液浓度为0.2～0.4 mol/l及0.6 mol/l时得到两个有β-葡萄糖苷酶酶活的蛋白峰，收集酶活峰各管，透析后用聚乙二醇浓缩后，用SDS-PAGE分析，其中一个酶活峰是一条单一的蛋白带，分子量为44 kD，见图2。
2.2 粗酶最适作用温度
在不同的反应温度下测定粗酶β-葡萄糖苷酶酶活。图3显示，在30～55 ℃条件下，β-葡萄糖苷酶酶活随温度的升高而增加，在55 ℃时β-葡萄糖苷酶酶活达到峰值，说明55 ℃是该酶最适作用温度。
2.3 粗酶最适作用pH值
按照文中方法，分别在pH值3～7环境下测定酶活。由图4表明，缓冲体系中的pH值小于3.5时显著影响β-葡萄糖苷酶酶活，在pH值3.5～5.5内酶活相对稳定，最适作用pH值为4.5。
按照文中方法，考察温度对酶稳定性的影响。图5表明，温度对酶的稳定性有很大的影响，在30～70 ℃范围内残留的酶活随着温度的升高和保温时间的延长酶活降低，且温度越高降低速度越快，在50 ℃以下保温1 h，酶活力降低缓慢，残留的酶活在80％以上，在40 ℃下保存5 h，残留的酶活在50%以上。
2.5 金属离子对粗酶酶活的影响（见图6）
在反应体系中添加一定浓度的金属离子，测定酶活。图6表明，金属离子不同程度的抑制粗酶β-葡萄糖苷酶酶活性，其中以Hg、Al、Pb最为严重，可能是引起了蛋白质变性。
2.6 底物浓度对粗酶反应速度的影响及热学动力学参数Km和Vmax的测定
按照文中的方法，分别测定酶与不同浓度底物反应时的反应初速度。图7表明：当底物浓度增大，酶反应速度增加；底物浓度在0～0.2%范围内为一级反应；底物浓度在0.2％～0.6%时随着底物浓度的增加，酶反应速度不再和底物浓度成正比例的方式增加，为混合级反应；底物浓度在大于0.6%时，酶被底物饱和，为零级反应。按照双倒数作图法求得热学动力学参数Km和Vmax值分别为0.729×10-2 g/ml、1.36×10-2 mg/(ml·min)。
3 讨论
3.1 液体发酵液经过除菌、硫酸铵分段盐析、DEAE-SephadexA50离子交换柱梯度洗脱收集活性峰时，当氯化钠洗脱液浓度为0.2～0.4 mol/l时，收集到的蛋白活性峰为三条蛋白带，分子量分别为97、44、36 kD，当氯化钠洗脱液浓度为0.6 mol/l时，分离纯化得到电泳纯的β-葡萄糖苷酶，分子量约为44 kD。可见，氯化钠洗脱液浓度为0.6 mol/l时分离效果最佳。
3.2 通过对菌源性β-葡萄糖苷酶特性研究结果表明：粗酶最适作用温度为55 ℃，温度对该酶稳定性影响显著，但1 h内在50 ℃以下酶稳定性良好；最适作用pH值为4.5，在pH值3.5～5.5范围内酶活比较稳定；金属离子对酶活有不同程度的抑制作用；热动力学参数Km和Vmax分别为0.792×10-2 g/ml、1.36×10-2 mg/(ml·min)。初步的试验证明，该酶性质比较稳定，对底物亲和力较强，具有较大的开发利用价值。
（编辑：高 雁，snowyan78@tom.com）
李剑梅，辽宁省微生物科学研究院，副研究员，122000，辽宁省朝阳市文化路二段22号。
修翠娟、李莉、王振丽，单位及通讯地址同第一作者。www.cnenzyme.com
