何经纬 王之盛 曾有均
目前动物性蛋白原料价格上涨，导致了对高品质植物性蛋白质需求量的增加。在世界范围内，饲料中的绝大部分蛋白质来自油料种籽和豆科作物等植物性蛋白，豆粕又是应用最广泛的植物饲料蛋白质资源，其蛋白质含量高，除富含蛋氨酸外，其它氨基酸也较平衡，但是由于大豆中存在一些抗营养因子，如抗胰蛋白酶因子、抗原蛋白，严重影响饲料蛋白源的生物学效价，从而限制了其在早期断奶仔猪和犊牛日粮中的应用。许多国家用热乙醇处理、膨化加工处理等方法去除大豆抗原，但这些处理方法成本高，安全性差，污染大，不宜推广。采用生物酶制剂对豆粕进行处理，条件温和，绿色安全。它通过破坏大豆抗原蛋白质的高级结构，从而达到破坏其抗营养因子的作用，提高仔猪对饲料的利用率。
1 材料与方法
1.1 材料
豆粕（CP 48.165％）、中性蛋白酶（无锡市某公司提供）。
1.2 测定指标
氨基氮含量（mg/g）的测定参照黄伟坤(1989)的方法进行；蛋白质水解度（DH％）的测定参照赵新淮等(1995)的方法进行。
1.3 中性蛋白酶水解条件的确定
1.3.1 最适温度的确定
中性蛋白酶使用的稳定pH值范围为6.5～7.5，取初始pH值为7.5，故安排试验如下：豆粕碎过120目筛，取1 g豆粕加水10 ml按照固液比(1：9，其中8 ml缓冲溶液，1 ml酶液)，加酶量E/S=1%(质量百分比)，分别在320、370、420、470 ℃水解30 min后，沸水浴加热10 min，离心10 min，取上清液过滤，定容至100 ml，取样测氨基氮含量。
1.3.2 最适水解时间的确定
样品处理同上，在确定的最适温度下，pH值为7.5，加酶量(E/S)为1%，取水解时间分别为3、4、5、6 h，沸水浴加热10 min，离心10 min，取上清液过滤，定容至100 ml，取样测氨基氮含量。.jpg)
1.4 统计分析
用Excel对数据进行初步处理，以SPSS13.0统计软件对数据进行回归分析，LSD法进行多重比较。
2 实验结果
2.1 酶水解温度的确定（见表2、图1）.jpg)
由表2、图1的实验数据表明，中性蛋白酶随温度的提高，水解活性逐渐增强，达到42 ℃时，相同时间内产生氨基氮的量和蛋白质被酶水解程度最大，以后随温度的提高，中性蛋白酶的水解活性明显降低。在42 ℃条件下水解产生氨基氮的量比32、37 ℃条件下水解产生氨基氮的量分别提高了76.78%(P<0.01)和56.77%(P<0.01)；而在47 ℃条件下比42 ℃时减少了60.94%(P<0.01)。实验还表明，在42 ℃条件下蛋白质被酶催化水解的程度比在32、37、47 ℃时分别高出1.23、1.03、1.73个百分点。用二次回归曲线求出最适水解温度为41.36 ℃（R2＝0.999 7）。
2.2 酶水解时间的确定（见表3、图2）
由表3、图2结果表明，随酶水解时间的延长，氨基氮的产生量逐渐增加，蛋白质被酶水解程度逐渐提高，4 h比3 h提高了22.03%(P>0.05)，5 h比4 h提高了9.19%(P>0.05)，6 h比5 h提高了1.30%(P>0.05)，它们的变化幅度逐渐减小,但水解6 h时氨基氮的平均产生量比3、4 h时分别提高了34.97%(P<0.01)和10.59%(P>0.05)。蛋白质被酶催化水解的程度5 h比3、4 h时分别高出2.49和0.85个百分点，比水解6 h下降0.13个百分点。由此表明，水解效果随时间的延长并不是呈线性上升的关系，达到一定程度氨基氮的产生将停止。结合水解效率和实际生产运用，水解时间5 h左右为宜。
3 讨论
3.1 温度对酶解效果的影响
大多数化学反应的速率都和温度有关，酶的催化反应也不例外。每种酶在一定条件下都有其最适温度。实验结果表明，中性蛋白酶在反应的最初阶段，酶蛋白的变性尚未表现出来，因此产生氨基氮的量随温度升高而增加，但高于42 ℃时，酶蛋白变性逐渐突出，反应速率迅速随温度升高的效应逐渐被酶蛋白变性效应所抵消，氨基氮产生量下降。中性蛋白酶在42 ℃水解豆粕产生氨基氮的量极显著高于其余温度下的产生量(P<0.01)，即产生的氨基氮最多，酶的水解活性最高，说明温度的高低对酶活性的影响相当大。根据二次回归曲线求出在此实验条件下中性蛋白酶适合反应温度是41.36 ℃(R2=0.999 7)。李磊等(2002)对大豆饼粕进行中性蛋白酶水解处理的最适温度为40 ℃。李树品等(1997)做了应用中性蛋白酶对豆粕进行水解的实验，确定pH值为7.0、温度为45 ℃为最适水解条件。产生温度差异的原因可能是：①豆粕所过目筛不同，酶与底物结合后造成酶活性中心结构的改变影响其催化活性；②水解反应过程中pH值的变化造成的。从仔猪实际生产角度考虑，初生仔猪的体温在39.5 ℃，所以，在仔猪体内中性蛋白酶接近它的最适反应温度，能够一定程度上发挥酶的最大水解活性，在此温度条件下，中性蛋白酶的活性较高，能够一定程度的水解蛋白质、破坏大豆抗原蛋白的高级结构，从而破坏抗营养因子，提高饲料蛋白质的利用率，降低仔猪腹泻。对于消化酶分泌不足的幼龄动物通过添加生物酶制剂可以增加消化酶的种类和数量，提高其对各种物质的消化和吸收。
3.2 时间对酶解效果的影响
中性蛋白酶水解豆粕产生氨基氮的量随水解时间延长而逐渐增大，但水解到5 h后，氨基氮产生速度减缓，水解6 h产生氨基氮的量极显著高于水解3 h产生氨基氮的量(P<0.01)，该结果与龙定彪(2004)、吕刚等(2005)的实验结果相同；水解度与吕刚等(2005)的实验结果相同。考虑到随水解时间延长，底物不断消耗，其浓度逐渐降低，酶也逐渐失活；另外生成的产物在释放出来之前与酶以复合体形式存在，可以占领酶分子上的特殊位点，使酶不能结合底物，产生竞争性抑制；或者占据催化部位，对结合了的底物不能发挥催化作用。所以达到一定程度后水解速度必然随之减慢。由于饲料在仔猪小肠中停留的时间为4～5 h，在这段时间内，中性蛋白酶能够和底物充分结合，使肽键破裂，降解大豆抗原蛋白成为氨基酸或者多肽，这样有利于小肠的吸收和利用，减少氮的排泄，降低养猪业的环境污染，同时生产出无药物残留，有利于人类健康的安全肉产品。但水解时间太长，酶水解效率达到一个平台期，氨基氮产生量和水解度没有显著变化（P>0.05），而且食糜在5 h后将进入大肠，不利于仔猪的消化吸收。
4 结论
中性蛋白酶水解豆粕在pH值7.5、酶用量(E/S)为1%、固液比为1：9时的最适水解温度为41.36 ℃，水解时间为5 h左右。
（参考文献11篇，刊略，需者可函索）
（编辑：高 雁，snowyan78@tom.com）
何经纬，四川农业大学动物营养研究所，625014，四川省雅安市雨城区新康路36号。
王之盛、曾有均，单位及通讯地址同第一作者。
