全球气候变化、石油供应紧张以及能源安全问题加大了对运输燃料替代品的需求。微生物可以合成类似于汽油等运输燃料，这类微生物的培养技术与目前的引擎装置和石油储运设施相匹配，同时不需重建非石油类生物燃料的储运设施，可以节省大量资金。然而，微生物合成运输燃料的工艺发展一直存在着严重阻碍，如合成生物（非模式生物）基因工程改造，优化代谢途径和维持工程菌氧化还原状态，酶的低活性，以及上游生物质加工过程中微生物合成副产物和燃料的抑制效应都使生产的潜在可能性受到限制。合成生物学和代谢工程的研究进展为解决这些难题提供了方法。加利福尼亚大学伯克利分校的Jay D Keasling 撰文《Metabolic engineering of microorganisms for biofuels production:from bugs to synthetic biology to fuels》（Current Opinion in Biotechnology 2008, 19:556～563）分析了目前生物燃料的合成方法，讨论了代谢工程和合成生物学中的工具如何应用于基因工程微生物合成燃料。本文择其要点加以概述。
1引言
目前，广泛使用的生物燃料，通常为淀粉类（玉米）或甘蔗生成的乙醇或从植物油以及动物脂肪中提炼出的生物柴油。但是，乙醇具有高吸水性和腐蚀性，不利于现有的燃料基建设施运输和储存，不是最理想的燃料分子。同时，它只具有汽油70%的能值。生物柴油也有同样的问题：浊点和倾点（pour point）比其他石化柴油高，因此不能在管道中运输，能值比其他石化柴油低11%。
可再生木质纤维素运输燃料的微生物合成有以下优点：首先，合成原料不是如玉米、甘蔗、大豆和棕榈油这类粮食作物。其次，木质纤维素是地球上产量最大的生物高聚物。再次，新的生物合成途径可用于生产化石燃料替代品，包括短链、支链、环状醇类、烷烃、烯烃、酯和芳香类化合物。木质纤维素转化为燃料的经济高效型工艺的发展一直存在着严重阻碍，如合成生物（非模式生物）基因工程改造工具的缺乏，以及优化代谢途径和维持工程菌氧化还原状态的困难。此外，酶的低活性，以及上游生物质加工过程中微生物合成副产物和燃料的抑制效应都使生产的潜力受到限制。
2液体燃料和可再生生物燃料分子
重组微生物生产有效的替代性生物燃料，重要的是理解最佳燃料的组成。近期最佳的燃料目标是能够适用于现有引擎的燃料分子结构，这些结构或者已经在化石燃料中发现或者类似于化石燃料的组成（点火式引擎所用的汽油，压燃式引擎所用的柴油，燃气式引擎所用的喷气式燃料）。筛选替代生物燃料时需考虑一些相关因素（表1）：内能、以辛烷值或十六烷值表征的燃烧质量、气味、毒性都是重要的评价参数。
a衡量汽油抗爆震燃烧能力的一种数字指标。燃料和空气混合后到达最佳点燃压力和温度之前自发的爆震现象。b 燃烧时所产生的能量值。分子中C-H和C-C键的数量说明某种燃料燃烧时产生的能量。c 衡量柴油在柴油机中燃烧时的自燃性指标。短暂延迟点燃时注入燃料和燃烧开始之间的时间是首要考虑因素，延迟点燃由十六烷值来表征。
3合成主体
合成主体需将木质纤维素转变成经济型生物燃料。友好型寄主大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）有良好的基因，而操控这些基因的工具对于合成途径的发展是个良好开端。由于这些寄主微生物也是生长速率较快的兼性厌氧菌，大型生产工艺相对简单，并且经济可行。大肠杆菌和酿酒酵母用于制造可再生生物燃料的成功应用，需要对非稳态条件下生理特征及适应性变化进行研究。组学、计算系统生物学和合成生物学的不断进步将有利于对理想燃料生产主体的研究和工程化，使其成为可能。
4燃料合成途径的代谢工程
最近，一些生物燃料的合成途径在模式生物中进行了表达（表2）。例如，合成异丙醇和丁醇的梭菌（Clostriduim）基因在大肠杆菌中进行了表达。除了在发酵期间产生乙醇，酿酒酵母也可利用氨基酸生成高级醇和酯。目前，相似的高级醇生成途径在大肠杆菌得到表达，生产6种不同的直链和支链醇，同时通过理想途径增强稳定度，异戊醇的产量可达到1.28g/L。其他的合成途径包括生成脂肪酸以合成生物柴油（脂肪酸甲基/乙烷基酯）及生成烷烃。微生物合成生物柴油，主要为大肠杆菌和酿酒酵母的脂肪酸生物合成途径。除了天然途径，生物合成和化学合成的综合途径也可生成新化学物质作为生物燃料。
构建生物合成途径仅是生物燃料经济可行的第一个障碍。产量的期望以及成本的控制对合成生物燃料提出更大挑战。高产量是代谢网络互相依赖作用的结果，受以下代谢总体水平的强烈影响：ATP/ADP，NAD+/NADH，NADP+/NADPH和酰基羧酸。细胞中这些核心代谢物在调节多种途径时起着关键作用，因为细胞通过调节这些代谢的相对速率，改变途径活性以最终影响细胞生理活动。例如，一个细胞的还原状态基本取决于NAD+转化为NADH相对速率。生物燃料合成的新途径可以影响这些重要代谢的平衡，会生成非目标副产物，引起目标产物产量下降。此外，新的代谢途径需要氨基酸、氧化还原辅因子和能量来合成酶并将其功能化，增加了细胞代谢负担，需抑制新代谢途径反应来增大终产物产量。
“代谢模型”可用来预测新代谢途径对生长和产物形成的影响。近年来，大肠杆菌和酿酒酵母代谢的生物化学模型变得越来越复杂。“基因组分模型”（genome-scale models）以其较合理和系统的方法指导代谢工程。“电子模型”（in silico models）多数为可计量模型，由于描述这些模型的方程通常为待定方程，拥有较多参数。但是，合理确定参数可以实现建立基因型表型联系生产模式。“计量模型”（stoichiometic models）也可使用代谢通量分析（metabolic flux analysis，MFA）由一系列确定的方程来描述，通量变化可由实验获得。代谢通量分析已用于研究不同生长条件下大肠杆菌的代谢和生产重组蛋白。利用“代谢模型”可深入研究许多重要的微生物代谢过程，如预测不同碳源生长期间大肠杆菌适应进化的表型空间（phenotypic space）和大肠杆菌代谢网络高通量反应的拓扑组织（topological organization）。通过重组高通量反应速率，大肠杆菌可适应多种生长条件。“基因组分模型”研究有益于生物燃料的合成，它可以通过理想途径提供一系列框架来优化通量，同时可以调节重要辅因子和能量代谢之间的平衡。
“电子模型”在工程微生物利用新物质高效合成生物燃料过程中起到重要作用，广泛应用生物质原料，减少上游处理步骤，提高生物质到生物燃料的转化率，有助于降低生物燃料成本。例如，酿酒酵母将树干毕赤酵母（Pichia stipitis）中木糖还原酶（Xyl1p）和木糖醇脱氢酶(Xyl2p)整合到自身基因中，使其能够利用木糖——自然系统中含量丰富——作为碳源进行醇类生产。但是，简易过表达基因造成氧化还原反应的不平衡，导致增长率和发酵率降低。相对于NADH，树干毕赤酵母中木糖还原酶更易于与NADPH发生作用，同时木糖醇脱氢酶仅和NAD+发生作用。两个基因同时过表达会导致NADH的积累和NADPH的缺乏。“代谢模型”显示，通过去掉NADP+依赖的谷氨酸脱氢酶（GDH1），过表达NAD+依赖的GDH2，可以增强NADH Xyl1p的特定活性，调节辅因子平衡。这种方法可以提高乙醇产量，降低副产物的合成。
EM（Elementary mode）分析也被用于大肠杆菌工程改造，使其能够同时利用葡萄糖和木糖作为碳源生产乙醇。EM分析用来识别少数代谢途径，这些途径促进以己糖和戊糖为碳源的增长和乙醇生产，同时去除能够促进乙醇最大化和高生物质产量的反应，使得EM降到最低水平。通过这个方法，减轻了突变体敲除过程中不相关的途径所引起的负担。代谢工程的另外一个例子是，发酵阶段通过破坏三羧酸循环，降低NADPH氧化量以及消除NADH氧化途径而不是整个电子转移系统，抑制大肠杆菌副产物发酵。调节辅因子平衡的其他方法包括通过过表达以增加NADH或NADPH的有效性，互换NADH和NADPH，改变特定蛋白质的辅酶特异性。“电子基因组分模型”（In silico genome-scale models）除了用于基因缺失或过表达策略中，还可以用于氧化还原反应基因插入策略。硅片基因插入方法用于改进乙醇生产，降低丙三醇和木糖醇副产物的产率。甘油-3-磷酸脱氢酶被引入酿酒酵母，丙三醇降低了58%，木糖醇降低了33%，乙醇产量提高了24%。这些技术表明控制和平衡各种重要代谢过程的重要性，以实现优化产物浓度。因此，代谢工程在工程化高效微生物途径，合成经济可持续生物燃料中发挥着重要作用。
5生物燃料代谢工程中合成生物学的作用
合成生物学是一个新兴学科领域，旨在将诸如模块化和组件化这样的工程原理引入微生物遗传通路的操控中，燃料生产的生物工程化像组装电脑一样简单。较之于药品或者酶这类高成本稀有产品，燃料对成本尤其敏感。生物燃料仅在成本不高于钻探和炼制石油情况下才具有竞争力，因而生物燃料的发展前景完全取决于降低生产成本。为了实现这个目标，必须全面抑制任何可能引起产率降低的不相关的分子反应发生。抑制这些反应发生，促进产物前体快速生成，测试，优化途径和寄主生物的技术是非常关键的。
合成生物学的突飞猛进在于减少基因构建的时间和增强它们的可预测性和可行性。许多变异途径和序列的构建能够通过优化组合技术有效处理而不是合成每个所需序列。例如，自由黏结组合（ligation-free assembly）和生物积木法（BioBricks）能够利用已有的DNA片段和基因快速构建操纵子和反应途径。特别是生物积木法，在组合末端和起始位置都具有相同的酶切位点——即组合的每个阶段所使用的酶和工序都和前一阶段相同。此技术循环重复的特性有利于自动操作，快速生成大量序列。常规表达系统反向序列的发展，可用来微调表达，在工程代谢途径中非常有用。同样，感应环境变化并能反馈的开关序列，这种序列同时能够进行下游管理，是生物燃料生产的契机。例如，通过感应周围环境，细菌可由纤维消化模式转变为燃料生产模式。这样的高级信号处理和决策能力已有应用证明，例如，肿瘤感应细菌能够感应并选择性侵入肿瘤厌氧环境中——代谢工程采用这些技术可促进学科研究发展。此外，微生物细胞内和细胞间信号处理能力的发展以及途径表达的精密控制，为基因联合表达和优化生产控制提供了可能。
代谢工程最具挑战的一点是将几个部分或者酶途径片段组合为功能区（合成生物学中称为“功能组合”）。例如，Ro 等能够提取已优化的甲羟戊酸途径并用来合成青蒿酸。随着生物合成的分子数增加，再利用和混合酶途径或副途径也会增加。易于组装的分子途径的合成是一个充满潜力的活跃研究领域。为实现这个目标，必须寻找表征和标准化的构架。目前标准化测量的工作一直在推行，但必须进一步改进这些方法，如测定和表征以及工业化协定，特别是推行合成基因管理的初步发展和数学分析方法。展望未来，合成生物学的系统组织性发展是一项艰难需不断推进的工程。对于代谢工程，以提高产量为目的，一个工作途径需由一个生物转移到其他生物，这项工作非常困难但有时是必须的。合成生物学通过修饰已有的生物或者控制染色体以及一系列代谢途径重新创造生物。当外来基因或途径引入时，由于这些途径是可控的，类似生物能够产生预期行为。同样，有机体的突变行为和筛选技术在整个基因工程中占据重要位置。
通过把分途径简单组合形成组成明确的基底，成为新代谢途径组合是目前所关注的研究课题。近来合成生物学技术的迅猛发展为组装和控制技术引入新工具，推动整个领域发展实现此设想。合成生物学中许多技术可应用于微生物代谢工程生产燃料，并且代谢工程和合成生物学之间已相互渗透，形成不可分割的关系。合成生物学中日益发展的一系列工具的快速应用，有利于解决棘手的代谢工程问题，如生物燃料的生产。
6结论
近来能源和燃料成本的增长引起人们的关注，化石燃料的替代品成为我们的研究重点。但是，与20世纪70年代和80年代早期生物燃料发展不同的是，我们具有更先进的工具来操控细胞代谢合成燃料。更重要的是，合成生物学的先进工具使得研究非天然生物燃料菌成为可能，能够利用现有的运输设施，不需修建新设施利用如乙醇等“自然”生物燃料。无论何种情况，代谢工程和合成生物学在生物燃料改进中都是研究重心，本文中提到的合成分子和生物技术在生物燃料改进中都发挥了重要作用。
