植物中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化
一、实验目的
1通过超氧化物歧化酶的分离纯化，了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换柱层析方法的原理。
2掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。
二、实验原理
（一）SOD的性质
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。
SOD金属蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。
它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn—SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn—SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe—SOD)。
SOD催化如下反应： O2-+ O2-+2H+一H202+O2
（二）SOD的分离提取
蛋白质包括酶的分离纯化方法很多，主要有：①根据蛋白质溶解度不同的分离方法，蛋白质的盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法；②根据蛋白质分子大小的差别的分离方法，透析与超滤、凝胶过滤法；③根据蛋白质带电性质进行分离，电泳法、离子交换层析法。④根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法。
1、酶的提取纯化：在分离制备时首先将植物细胞破碎，用提取液制备粗酶液。经加热变性、有机溶剂沉淀除去大量杂蛋白，再用DEAE-纤维素柱层析或DEAE-葡聚糖柱层析纯化，可得到更纯的酶。经过以上分离纯化步骤后，酶可提纯100倍以上。
大部分酶都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用水溶液提取分离和纯化酶。稀盐和缓冲系统的水溶液对酶稳定性好、溶解度大,是提取酶最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于酶的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数酶的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使酶变性失活，因此，基于这一点考虑提取酶时一般采用低温（5℃以下）操作。
由于SOD是金属酶,其金属离子对热有稳定的影响,所以SOD对热比较稳定.一般情况下,SOD表现出短时间的耐热性能,据资料报道当反应温度为88℃,时间为15-30分钟时对酶活性的影响不大.而一般杂蛋白在55℃以上时就容易变性。因此，采用热击变性法对粗酶进行处理,以除去一部分杂蛋白。
极性有机溶剂能引起蛋白质脱去水化层，并降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒凝集而沉淀。采用这种方法沉淀蛋白质时，要求在低温下操作，并且需要尽量缩短处理时间，避免蛋白质变性。为此选用低温有机溶剂沉淀法进一步纯化酶。
Cu·Zn-SOD的pI为6.8，将上一步收集的SOD丙酮沉淀物溶于蒸馏水中，在pH7.8的条件下，Cu·Zn—SOD带负电，过DEAE—32纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。
离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。
离子交换柱层析基本装置及操作方法
1）柱层析的基本装置
柱层析的基本装置示意图如图3－3 所示：
2）柱层析的基本操作
柱层析的基本操作包括以下一些步骤：
⑴ 装柱
柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。
首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为1:10~50；凝胶柱可以选1:100~200，同时将柱子洗涤干净。
将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，加适量1mol／L NaOH溶液，搅匀后放置15min，用G3烧结漏斗抽滤，水洗至中性，滤饼悬浮于1mol／L HCl溶液中，搅匀后放置10min后用Gl烧结漏斗抽滤，水洗至中性，滤饼再悬浮于1mol／L NaOH溶液中，抽滤，水洗至中性，并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。最后将滤饼悬浮于层析柱平衡缓冲液中待用。
关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢
地倒入柱中，使其沉降约3cm高。
打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。
最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm高的缓冲液，同时关闭出水口。（可采用机械化装柱法）
⑵ 平衡
柱子装好后，要用用pH7.8，2.5mmol／L磷酸钠缓冲液作层析柱平衡液平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为3~5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。
⑶ 加样
加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。
应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。
