关键词：木聚糖酶；还原糖法；酶活梯度曲线检测法
木聚糖酶是饲用酶制剂家族中的重要成员，从全球范围来看，大约已有65%—75%的谷物饲料中添加了以木聚糖酶为主的非淀粉多糖酶。木聚糖酶不但能有效改善饲料营养价值，还能促进动物生产性能的提高，是当前消除饲料中木聚糖抗营养作用最为有效可行的措施之一。同时，木聚糖酶的应用也为缓解能量饲料资源的短缺、开辟非常规饲料资源提供了新的途径。
饲用酶制剂活性分析与检测在饲料工业中具有重要的作用：一是酶制剂生产企业可用于检验监控每批产品质量的稳定性；二是添加于饲料中的酶制剂在与饲料一起经过加工制粒工艺后，势必会造成酶活性的损失，因此饲料加工工业可以通过检测成品饲料中酶制剂的含量来验证其添加效果（即饲料中酶的存活率），以保障饲料品质。
目前，我国仍缺乏统一的饲用木聚糖酶检测方法，而丹磺酰氯(DNS)还原糖法由于具有操作简便，显色稳定，重现性好，且不需特殊仪器设备等优点，成为了众多科研单位和饲料酶制剂生产企业公认的测定方法。由于加酶饲料中木聚糖酶的添加量较少，且存在着较多的干扰因素，使得木聚糖酶的准确测定变得较为困难，这已成为许多饲用酶制剂科研工作者、生产者和使用者普遍关心的问题。因此，本文归纳了饲料中木聚糖酶检测的影响因素；同时在DNS还原糖法的基础上提出了酶活梯度曲线检测法的概念，以期为检测饲料中木聚糖酶的方法提供可行性参考。
1影响检测加酶饲料中木聚糖酶的因素
1.1饲料自身的干扰因素
1.1.1碳水化合物
植物性饲料中含有多种碳水化合物，如淀粉、木聚糖、纤维素及果胶等。这些碳水化合物含有不等量的还原性醛基，在煮沸条件下均可与DNS显色剂发生显色反应。在浸提饲料的木聚糖酶的过程中，饲料本身含有的一些可溶性碳水化合物也会随之溶入浸提酶液中，其具体含量见表1。
表1浸提酶液内的干扰物含量mg．mL-1
| 项目 | 总糖 | 戊聚糖 | 果胶 | 还原糖 |
| 干扰物含量 | 7.1 | 0.28 | 0.139 | 124 |
1.1.2矿物金属离子
矿物金属离子对酶制剂活性的作用表现为两方面：一是作为酶必不可少的辅助因子，稳定酶的构象，起激活剂的作用；二是当金属离子浓度过大或为重金属离子时，会影响底物与酶的结合甚至使酶变性失活，起抑制剂的作用。魏有霞等报道，Na+、K+、Fe3+对木聚糖酶的活性有激活作用；Fe2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+对木聚糖活性具有抑制作用，且抑制能力依次增大。李卫芬等报道，Fe2+、Fe3+、Cu2+、2ri2+对木聚糖酶活性有抑制作用，且Cu2+抑制作用最强；C02+、Mri2+则能促进其活性，其他离子对木聚糖酶活性影响较小。王在贵等的研究则发现，包括Ca2+、Fe2+、Mri2+在内的多种二价金属离子对木聚糖酶活性均有不同程度的抑制作用。由此可见，金属离子对木聚糖酶活性的影响是一个较为复杂的过程。
饲料中含有数量可观的矿物金属离子，其一方面来源于饲料原料，另一方面则是根据动物营养生理的需要，在饲料配制过程中添加的常量和微量矿物元素。在浸提木聚糖酶的过程中，饲料中含有的一些矿物金属离子也会随之溶入酶液，并对后续酶活力的测定产生促进或抑制的影响，从而干扰了酶活检测。此外，饲料中含有的矿物金属离子（如Fe2+、Cu2+等），其自身的水溶液就有一定的颜色，因此也会影响待测酶样本的底值，增加检测误差。
1.1.3饲料系酸力
饲料系酸力是指用1molHC1滴定100g饲料的水溶液，当pH下降到4.0时所消耗的盐酸量。饲料原料的选择及各原料组分间的比例影响着饲料系酸力；同时，动物种类及日龄上的不同对日粮系酸力的要求也有一定的差异性。在浸提加酶饲料中木聚糖酶的过程中，饲料自身的系酸力会对提取酶液的pH产生不同程度的影响。笔者做了如下试验：从市场收集6份(A~F)不同饲料样品并粉碎过40目筛，分别各称取样品5.0g于100mL容量瓶中，加入pH5.5缓冲液70mL，置于恒温振荡器中摇匀30min，定容、离心后取上清液测定pH，结果见表2。
表2饲料系酸力对浸提缓冲液pH的影响
| 项目 | 饲料A | 饲料B | 饲料C | 饲料D | 饲料E | 饲料F |
| pH | 5.55 | 5,63 | 5,63 | 5.58 | 5.67 | 5.64 |
1.1.4其他非淀粉多糖酶的影响
在饲用酶制剂的应用过程中，木聚糖酶可以与纤维素酶、果胶酶等经过复配后以复合酶的形式添加应用于饲料中。故在浸提此类饲料木聚糖酶的过程中，其他酶也会溶于酶液中。这些酶催化水解相应的多糖底物均产生还原性糖，使得饲料中木聚糖酶的测定值偏高。因此，在分析饲料中某种酶制剂活性时，如何消除其他酶对测定结果的影响（尤其是检测方法较接近的酶制剂）仍需进一步探讨[8J。
1.2酶活检测操作过程中的影响因素
1.2.1饲料样品的称样量
酶制剂活性检测通常先称取待测样品，再用一定量的缓冲液浸提目的酶蛋白，并进一步稀释到适宜倍数后测定其酶活性，最后乘以稀释倍数，即得待测样品的酶活力。对于木聚糖酶纯品而言，其酶活值较高，称取少量酶样(0.2~0.5g)即能满足酶活测定需求；而对于检测饲料中的木聚糖酶而言，由于在配合饲料中木聚糖酶的添加量较少以及饲料的稀释作用，使得酶浓度大大降低，故需要增加待测饲料样以达到测定需求。
对此，笔者做了如下试验：称取5.0g饲料样品数份并粉碎过40目筛，分别置于100mL容量瓶中，用水定容并准确计量所用水的体积。试验结果表明，定容装有5.0g饲料样品的100mL容量瓶所用去的水的平均体积为96.2—96.5mL。因此，5.0g饲料样品的稀释倍数应该是96.2～96.5倍，而不是通常所认为的100倍。故若按稀释100倍来计算饲料中木聚糖酶的含量，无疑增大了检测误差。
1.2.2酶蛋白的浸提温度
在浸提饲料木聚糖酶的过程中，饲料中含有的木聚糖等可溶性底物或底物类似物也会随之溶入浸提酶液，故在浸提的过程中酶与底物也会同时发生水解反应生成还原糖，造成测定背景值偏高，增大检测误差；同时随浸提温度的升高，酶解反应速率加快，对测定结果的影响也越大。建议在4℃环境下进行酶蛋白的浸提，以降低酶液提取过程中木聚糖酶对底物水解的程度，减小检测误差。
2酶活梯度曲线检测法
由于饲料本身的变异度较大、饲料成分的复杂性导致的酶浸提液中干扰因素较多，因此DNS还原糖法不适合直接用来测定饲料中木聚糖酶含量。此外，黏度法、酶联吸附分析法等检测方法也由于其自身存在的一些缺陷而不适宜检测饲料中的木聚糖酶[10]。
陆文清等报道，在DNS还原糖法的基础上对其进行一定改进，可以较好的实现加酶饲料中木聚糖酶的测定。笔者经过多次试验摸索，并在陆文清等提出方法的基础上又做了进一步的改进。酶活梯度曲线法可以较好地检测加酶饲料中木聚糖酶的含量，其操作方法如下：称取数份等量的未经酶处理的饲料（约2.0 g）分别装于100 mL容量瓶中，加入70 mL缓冲液，置于恒温摇床30 min；依次添加不同梯度已知酶活的木聚糖酶溶液，摇匀、定容、离心，分别取上清液经pH计校正后按照DNS还原糖法测定其酶活，得到相应的OD值，并绘成酶活梯度曲线；最后对照分析曲线测定计算加酶饲料中木聚糖酶的含量。此酶活梯度曲线法由于在曲线制作时已经考虑了饲料自身的干扰因素，因而提高了加酶饲料中木聚糖酶检测的准确性。
