以96孔盘来量测HRP(Enzyme;酵素)水解TMB(Substrate;受质)的酵素活性实验

实验背景
酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由於结合於固体承载物(一般為塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅\进行定量分析。
TMB (3，3 ，5，5 -四甲基联苯胺; 3,3\',5,5\'-tetramethybezidine) 是免疫法实验常用的一个受质，Horseradish peroxidase (HRP)水解TMB会呈现蓝色(吸收Abs.620)、当加酸停止反应会呈现黄色(吸收Abs. 450)。
一般在酵素水解受质通常都会跟浓度、pH、抑制剂存在与否有关，本实验的目的為以96孔盘来量测HRP (Enzyme;酵素)水解TMB (Substrate;受质)的酵素活性实验。

实验步骤
(A) 酵素浓度与酵素反应速率关係
1. 於96孔盘分别加入0、1、2、4、6l 含HRP溶液。
2. 加入200l的酵素受质TMB。
3. 点选软体中，名称為HRP_620nm之程式，量测620nm吸收间隔30秒共10分鐘。
4. 最后加入50 l的2N HCL停止反应。
5. 点选软体中，名称為HRP_450nm之程式，改以450nm量测其吸收值。
(B)抑制剂与酵素反应速率关係
1. 於96孔盘加入5l 含HRP溶液共五组。
2. 加入10l的100mM 不同金属离子，依序為水、Ca、Cu、Mn、Cd。
3. 加入200l的酵素受质TMB。
4. 点选软体中，名称為HRP_620nm之程式，量测620nm吸收间隔30秒共10分鐘。
5. 最后加入50 l的2N HCL停止反应。
6. 点选软体中，名称為HRP_450nm之程式，改以450nm量测其吸收值。note: TMB 10X dilute anti mouse-HRP 10000x dilution

问题与讨论
讨论為何TMB加酸后顏色会从蓝色变為黄色?
跟据实验数据，请说明酵素反应速率与酵素浓度、离子的关係。