【实验操作】
1.蛋清的制备
将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml.
2.鸡蛋清粗分离
按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。
3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析
⑴ D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/L NaOH搅拌浸泡并搅拌4～8小时，抽滤干NaOH, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCl , 用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.5 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。
⑵ 装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～20cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。
⑶ 上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1ml/min。
⑷ 洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液。
⑸ 聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。
(6) 透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。
4.Sephadex G50分子筛柱层析
⑴ 装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除去乙醇，用6g/LNaCl溶液搅拌Sephadex G50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为此。(如果Sephadex G50是新的，则按实验五中的方法处理凝胶)。加入胶体积1/4的6g/L NaCl溶液，充分搅拌，超声除去气泡，装入玻璃层析柱（1.6×50cm），柱床45cm。
⑵ 上样：与实验五中的方法相同。
⑶ 洗脱:样品流完后，先分次加入少量6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为0.5mL/min，用部分收集器收集，每10分钟一管。
⑷ 聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。
⑸ 透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。收集透析液，量取体积。
5. 溶菌酶活力测定
⑴ 酶液配制：准确称取溶菌酶样品5mg, 用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50µg/ml.
⑵ 底物配制：取干菌粉5mg加上述缓冲液少许，在乳钵中（或匀浆器中）研磨2分钟，倾出，稀释到15～25ml，此时在光电比色上的吸光度最好在0.5～0.7范围内。
5.3 活力测定：先将酶和底物分别放入25 OC恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后吸取样品液0.2mL（相当于10µg酶），每隔30s读1次吸光度，到90s时共计下四个读数。
活力单位的定义是：在25℃，pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1个活力单位。
酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001
比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质
6. 蛋白质含量的测定
采用Folin-酚试剂法进行测定。（参见实验二）
7. 纯度检测
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。（参见实验六）
8. 理化和酶学性质的测定
学生可根据酶纯化和活力测定的结果，运用已掌握的生化知识和实验技能自行设计方案进行探索研究。
【实验结果】
步骤项目 体积(ml) 总蛋白量(mg) 总活力
单 位 比活力
(单位/mg) 回收率(%)
1.制备蛋清
2.溶菌酶分离
3.D152树脂柱层析
4. Sephadex G50层析
【思考题】
1．请说出其它提取和纯化溶菌酶的方法吗？请写出相关的方法及原理。
2．根据自身的实验体会，写出优化本实验的措施。
