六、纯化方法
领袖说过：不管黑猫白猫，抓到老鼠就是好猫。对纯化来讲，能拿到纯度好的蛋白，符合你纯化的要求就是硬道理。纯化方法不好讲，各种蛋白不一样，纯化工艺自然不同；即使相同的原料也有不同的纯化方案。纯化的方法我们有层析、沉淀、萃取、透析、超滤等等。
柱层析是纯化最强有力的手段，几乎每种蛋白的纯化都会用到层析。各种层析方法：如亲和、离子交换、疏水、反相、分子筛等等都是我们工艺宝库里的吃饭家伙。不知道怎么吃啊，没办法了，你还是先去补一补基础知识吧。GE公司的一套书个人认为是最佳的入门资料，如Recombinant Protein Purification，Affinity Chromatography，Ion-Exchange chromatography，Gel Filtration，等等，在GE的网站上应该能下载到，或者干脆打个电话给GE的销售员或技术支持，请他给你一个光盘就什么都有了。
在做纯化之前，我们需要知道一些待纯化蛋白的信息。如蛋白质序列，载体类型，理论等电点，理论分子量，疏水性等等，这些都是computer paper work，电脑上查查就有了。如果还能查到一些与目标蛋白纯化相关的文献也不错，不过没有也没关系。我是较少查文献的，奉行的原则是：与其看不如自己做，看了也难以做出来，做不出来了再去看。我就是一个工匠，操作工，而不是做科学的哦。这也是我对纯化的看法，好听一点的就是实践的科学，哈哈。
查文献的目的不在于copy它的纯化工艺，这是新手最最常犯的毛病，以为copy文献就能完成纯化工艺了。要知道文献的真实性是有一点折扣的，作者的原料和纯化的目的与你也不相同。查文献的主要目的在于了解你要纯化的蛋白的性质，它的一些检测方法，特别是有关于活性的检测方法。
怎么讲这一节呢？各种纯化的原理我就不讲了，也不可能有瑞典老兄书上讲得好（GE层析的根在瑞典的uppsala），还是举例来说明吧，做一些简单的分析。讲两个实例，一个是可溶表达的蛋白，一个是不可溶表达的蛋白。
（一）、可溶表达的蛋白A
1、computer paper work：
大肠杆菌BL21，pET32a载体融合表达，N端融合Trx（硫氧还蛋白109aa）和his6-tag（共49aa），DDDDK肠激酶位点后为需要的目标蛋白A，融合蛋白的分子量为21.2kd，Trx（DDDDK前）的分子量为17.1kd，蛋白A的分子量为4.1kd，蛋白A稳定性好，水溶性好，融合蛋白的理论等电点为5.9，Trx（DDDDK前158aa）的理论等电点为5.4，蛋白A的理论等电点为9.7。
2、纯化要求
符合重组药用蛋白要求，SDS-PAGE纯度大于95%，HPLC纯度大于95%，Western Blott单一条带，去除内毒素。
3、纯化设计分析
此为一典型的小分子蛋白融合表达实例。
由于有his6-tag融合可溶表达，可以采用Ni柱来进行初步纯化。
融合蛋白的理论等电点为5.9，可以考虑用Q柱、DEAE柱来吸附纯化。
融合蛋白需要酶切去除融合片断，要做肠激酶酶切工艺。
蛋白A的理论等电点为9.7，可以考虑用SP柱来吸附纯化。
酶切后的蛋白纯化可利用his-tag和pI的差异。
目标蛋白的分子量较小，有可能试一试反相纯化。
纯化样品要求去除内毒素，可以用Q柱、DEAE柱来吸附内毒素。
4、纯化流程
（1）破菌离心：
采用pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl缓冲液超声破菌，离心上清过滤后，量体积，加咪唑至55mM，调节pH为8.0。
点评：破菌缓冲液先不加咪唑，是为了更精确的保证咪唑的浓度，因为破菌过程中，菌体内液体的释放会稀释咪唑浓度。
同理，上柱前的样品要调节pH，因为破菌会使样品的pH下降，细心的话，检测一下，可见pH会从8.0下降到7.7-7.8左右。
55mM咪唑浓度是经过了分段洗脱优化的结果，最大程度地保证目标蛋白吸附，而杂蛋白穿透。做优化时，起始的咪唑浓度一般选择10-20mM咪唑，5-10mM分段加上去。
（2）Chelating Sepharose FF柱纯化：
pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl，55mM咪唑缓冲液平衡后上样；相同缓冲液淋洗完全至基线；150mM咪唑，pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl洗脱融合蛋白；250mM咪唑，pH8.0，20mM PB，0.5N NaCl洗脱杂蛋白。
点评：Chelating Sepharose FF填料是Ni-IDA类型的介质，最大的好处就是可以反复再生使用，特别是脱镍后用NaOH洗柱可以有效地去除内毒素，彻底将填料清洗干净。
150mM咪唑洗脱融合蛋白也是前期分段洗脱优化的结果，综合考虑了纯度和收率以及收样体积的因素。更低的咪唑浓度，如100-120mM咪唑也可将融合蛋白洗脱下来，但是洗脱峰很拖尾，纯度虽然好一些，可收样体积要大许多，收率也略低。
250mM咪唑洗脱杂蛋白不是此工艺中的要点。实际上，我们在操作过程中往往没有此步骤，就直接用EDTA将柱脱镍再生了。
镍柱在上样后的缓冲液淋洗阶段，峰往往很拖尾，要耐得住性子，让它淋洗完全。
此柱的融合蛋白载量大约为20mg/ml。不同的镍柱，不同的蛋白，载量也是不同的。
经过一步Chelating Sepharose FF纯化，融合蛋白的SDS-PAGE纯度大约为90%。
（3）Sephadex G-25（fine）换液
pH8.0，20mM PB做缓冲液置换。更换Chelating柱洗脱融合蛋白的溶液体系，使得适合肠激酶酶切的要求。
点评：Sephadex G-25（fine）的上样量大约为柱体积的30-35%，有轻微的纯化作用，有时候可以去除一些电泳上看不到的小分子杂质。
在酶切之前，本例也做过Q柱吸附纯化融合蛋白试验，吸附没问题，也能做到进一步的纯化。只是后来在工艺整合过程中发现此步不是必需的，就省略掉了。
