汪德刚 李艳玲 樊克锋 汤法银
（郑州牧业工程高等专科学校，河南郑州 450011）
摘要：为探索纤维素酶对栀子苷提取的影响，用高效液相色谱法对栀子苷在提取过程中纤维素酶的用量及酶解时间进行系统研究。结果显示，在栀子苷的提取过程中加纤维素酶0.20％、酶解1小时可以获得较高的提取率。初步认为，在从栀子提取栀子苷的过程中加入纤维素酶可起到既节省时间又提高提取效率的目的。
关键词：纤维素酶；栀子苷
近年来，纤维素酶在各个领域应用极为广泛，例如化工、食品及提取天然产物等。然而纤维素酶在中草药提取方面的应用尚处于初步探索阶段[1]，本实验对纤维素酶对栀子苷提取的影响进行了试验观察。
构成植物药细胞壁的纤维素是由β-D-葡萄糖以1,4-β葡萄糖苷键连接，用纤维素酶酶解可以破坏 β-D葡萄糖苷键，使植物的细胞壁破坏，降解成还原糖，有利于对有效成分的提取。根据以上原理，我们对栀子进行了加酶组与未加酶组栀子苷溶出率的对比，并对酶解的时间进行了考察。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药材 栀子（购于安徽亳州，经性状鉴别无误），栀子苷标准品(中国药品生物检定所，为含量测定用，批号：0749-9605)
1.1.2 仪器 高效液相色谱仪（waters2695，美国waters公司），恒温水浴锅，恒温培养箱，粉碎机，酸度计，分析天平
1.1.3 试剂 甲醇（分析醇） R-10纤维素酶（活力单位2000U/g,北京经科宏达公司）
2 方法
2.1 栀子苷标准曲线的绘制
精密称取栀子苷对照品3mg,置100ml容量瓶中，，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1ml含30μg的标准品溶液。用该对照品溶液，分别取样1ul、5ul、8ul、10ul、12ul进样,记录色谱峰峰面积，以栀子苷的进样量为横坐标，以色谱峰峰面积为纵坐标做标准曲线，得出栀子苷的回归方程为：A＝1.4×106C＋1095.8 相关系数R＝0.99999，表明栀子苷在进样量0.03ug－0.36ug范围内与峰面积呈良好的线性关系。
图1 栀子苷标准曲线图
2.2 样品制备：
加酶1组：称栀子粉，加4倍量预温45℃的水，调pH至5-6，分别取酶0.1％、0.15％、0.20％、0.25％、0.3％、0.4％，加少量温水溶解后，逐渐加入样品中，搅匀，放入45℃恒温培养箱中1h取样，80℃烘箱中干燥。
加酶2组：称栀子粉，加4倍量预温45℃的水，调pH至5-6，取酶0.2%，加少量温水溶解后，逐渐加入样品中，搅匀，放入45℃恒温培养箱中，分别于0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0h时取样，80℃烘箱中干燥。
对比组：不加酶，其他处理方法同上。
2.3 栀子苷测定
栀子苷的测定采用高效液相色谱法[2]。
色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(15:85)为流动相；检测波长为238nm。
对照品溶液的制备 精密称取栀子苷对照品3mg,置100ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1ml含30μg的标准品溶液，即得。
供试品溶液的制备 取样品品粉末0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称重，超声处理5分钟，放冷，补重，滤过，精密量取续滤液10ml，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
测定时，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
图2 样品中栀子苷含量测定Hplc图谱
3 结果与分析
3.1 酶的用量对栀子苷得率的影响
加酶量分别为0.1％、0.15％、0.20％、0.25％、0.3％、0.4％，以不加酶为对照，45℃处理1h。栀子苷得率见表1。
表1 酶用量对栀子苷得率的影响
在一定的处理时间内，具有相同比活力的酶，酶用量不同影响栀子苷的得率。从表1看出，酶量在小于0.20％的范围内，随着酶用量的增加，栀子苷的得率有明显增加，这是因为纤维素酶是一类将纤维素水解成水溶性糖的复合酶，植物的细胞壁主要是由纤维素组成，栀子苷是胞内物质，栀子用纤维素酶处理后，细胞壁被水解，加速了胞内物质的溶出。但酶量进一步加大，栀子苷的溶出就和酶量不成正比了，这可能是因为栀子苷是苷元连接葡萄糖而组成，由于纤维素酶左右，使其失去葡萄糖降解成栀子苷元，从而降低了栀子苷的收率。
3.2 酶解时间对栀子苷得率的影响
试验时在栀子样品中加入0.20％的纤维素酶，酶解温度为45℃，酶解时间分别为0h、0.5h、1h、2h、3h、4h，与不加酶组相比较，栀子苷得率见表2。
从表2不加酶组可看出，酶解时间对栀子苷的溶出率是有影响的，基本上是随着时间的延长，栀子苷的溶出逐渐增多，但溶出率增加幅度不大；从加酶组可看出，加入酶以后，在1h以内，栀子苷的溶出增加了，但随着时间的延长，栀子苷的溶出呈下降趋势，可能是因为纤维素酶对栀子苷有酶解作用。两组相比较，加酶组栀子苷的溶出可以在较短时间内达到较高水平。
表2 酶解时间对栀子苷得率的影响
4 讨论
从该实验中可看出，在栀子的提取工艺中，加纤维素酶0.20％、酶解1小时可以获得较高的提取率，达到既节省时间又提高提取效率的目的。但在继续增加酶用量和延长时间时，栀子苷的得率会下降。这说明：（1）在一定酶浓度范围内，随着酶用量的增加，纤维素酶解率增大，但不是永远成正比。有文献报道，用纤维素酶对麦草进行酶解，在5g底物中，酶用量100mg之前，酶解速率增加较快，100mg之后增加缓慢【3】，说明一定量的纤维素在一定条件下，纤维素分子能和酶分子结合的点数有限，当这些结合点全部被纤维素酶分子占据后，再增加纤维素酶的量，起不到酶解的作用；（2）由于中药中某些成分性质的特殊性，在水中或是在酶存在的情况下不稳定，时间过长会引起该成分的分解或结构发生改变，在这种情况下就一定要注意酶作用时间的把握。因此，在用纤维素酶处理栀子时要注意酶的用量和酶解时间的掌握。
另外，大部分纤维素酶的活性受其环境的温度和pH值的影响。在最适pH值下，酶反应具有最大速度，高于或低于其值，酶反应速率均会下降。温度也是影响纤维素酶酶解反应速率的重要条件。所以，pH、温度对栀子苷的提取过程中有什么样的影响，以及样品制备的处理方法等其他因素是否也会影响到栀子苷提取还有待进一步研究。
参考文献：
【1】李艳玲，汪德刚，王海花.纤维素酶在畜牧业中的研究应用现状及展望[J].郑州牧业工程高等专科学校学报，2006，26（2）：17－20
【2】国家药典委员会编，中华人民共和国药典，一部【S】，化学工业出版社，2005：173
【3】张建安，张小勇，韩润林等.木素对纤维素酶解的影响及纤维素酶解[J].化学工程，2000，28（1）：38－43
