酶膜生物反应器制备核苷酸的研究
摘 要
5’-核苷酸广泛应用于医药及食品行业，在世界范围内核苷酸类药品、制剂成为研究和投资的热点之一，需求量日益增长。国内仅个别厂家能进行四种核苷酸生产，且产品纯度不高，产量不大，原料不足的问题严重制约了我国核苷酸类药物和衍生物的开发。酶膜生物反应器是在生物化工和膜分离技术的基础上发展起来的新型反应器，作为生物反应分离耦合过程的一个具体应用，其有不可比拟的优越性，在食品、生物化工、医药、环境等领域得到了越来越广泛的应用。为此本课题开展了酶膜生物反应器制备核苷酸的研究。主要研究了核酸酶P1的制备及分离纯化、游离及固定化酶膜生物反应器制备核苷酸、核苷酸的分离纯化等。
利用正交及响应面法优化了培养基成分，并对培养条件进行了优化，在最优条件下，可得到核酸酶P1最大酶活性354 U/ml。通过热失活、超滤、硫酸铵分级沉淀、疏水作用层析、离子交换层析以及凝胶层析等生化分离手段提纯得到了电泳纯核酸酶P1，酶蛋白比活为1264 U/mg，纯化倍数为93.4。研究了核酸酶P1酶学性质，得到了pH稳定性范围为4.0-7.0，最适pH为5.4；最适温度为69 ℃；Al3+、Cu2+ 、Co2+ 、SDS对核酸酶P1有明显的抑制作用，Zn2+、K+对核酸酶P1有明显的激活作用；米氏常数Km为24.28 mg/ml。
研究了游离酶膜通量衰减曲线，考察了温度、压力等对膜通量的影响，优化了游离酶膜生物反应器的操作条件，并通过单因素及曲面响应法确定了游离酶膜生物反应器制备核苷酸的最佳酶解工艺条件：底物浓度1.25 %、锌离子浓度6.0×10-4 mol/l、底物pH为5.3、加酶量0.080 mg/ml、温度为65 ℃、底物中醋酸缓冲液的浓度0.125 mol/l。在最佳条件下制备的核苷酸收率为12.15 mg/ml，平均转化率为97.2 %。
考察了纸纤维为载体的共价偶联法、壳聚糖微球和DEAE纤维素为载体的交联法等几种固定化方法，获得较优的固定化条件。研究了固定化核酸酶P1的酶学性质，与游离酶相比：最适pH提高0.5个单位，耐酸碱性也得到了提高；以壳聚糖微球和纸纤维为载体的固定化酶最适温度提高了10 ℃，热稳定性、存储稳定性都得到了提高；纸纤维固定化酶、壳聚糖微球固定化酶、DEAE纤维素固定化酶的米氏常数Km分别为5.72、96.58、27.21 mg/ml。
采用化学交联法和物理吸附法研究了以膜为载体的酶固定化方法，结果表明化学交联法优于物理吸附法。同时考察了上述几种固定化酶在膜生物反应器里的使用稳定性，相比较而言壳聚糖微球固定化酶比较适合，使用十次后残留相对酶活为96 %，核苷酸转化率为84 %。通过单因素及曲面响应法确定了壳聚糖微球固定化酶在膜生物反应器中制备核苷酸的最佳酶解工艺条件：底物浓度1.57 %、锌离子浓度6.0×10-4 mol/l、底物pH为5.4、加酶量0.080 mg/ml、温度为72 ℃、底物中醋酸缓冲液的浓度0.125 mol/l。在最佳酶解工艺条件下可得到最大核苷酸收率为14.52 mg/ml，转化率为92.5 %。
对酶解产物5’-核苷酸进行了分离纯化，先用阳离子交换树脂IR120分离出5’-AMP和5’-GMP，再用阴离子交换树脂IRA 400分离 5’-UMP和5’-CMP，考察了上样量、缓冲液流速、洗脱浓度、离子强度、pH值等因素对5’-核苷酸分离纯化工艺条件的影响，四种核苷酸都得到了很好的分离，回收率在80 %以上。
关键词：酶膜生物反应器，核苷酸，核酸酶P1，分离纯化
