（河北经贸大学生物科学与工程学院，河北石家庄050061）
[摘要]对采用黑曲霉、淀粉液化芽孢杆菌和酿酒酵母混合发酵产含复合酶饲料的培养基和发酵条件进行了研究。结果表明，30℃发酵48 h，发酵产物中纤维素酶酶活、蛋白酶酶活分别为1 265、3 236 u/g干曲。
[关键词]饲料，蛋白酶，纤维素酶
[中图分类号]S 816.79[文献标识码]A[文章编号]1003-5095(2010）09-0037-03
近年来，随着我国养殖业的不断持续发展，种种有关的问题也接踵而至，原料涨价，竞争激烈，环境污染以及药物残留等。如何开辟和充分利用饲料原料、增加产品竞争力、减少环境污染，微生态制剂及其发酵饲料为我们带来了新的思路。
国内外已报道的常见的多菌株混合发酵产饲用复合酶的菌株有黑曲霉和米曲霉[1]、米曲霉和酿酒酵母[2]，黑曲霉、绿色木霉和热带假丝酵母[3]，米曲霉、黑曲霉、热带假丝酵母和异常汉逊氏酵母[4]，黑曲霉、米曲霉、异常汉逊氏酵母和产朊假丝酵母[5]等。目前针对于动物品种、生理功能及饲粮种类而生产的特异性酶制剂产品很少，且生产菌株不稳定，易退化，酶系不全面。希望通过黑曲霉、淀粉液化芽孢杆菌和啤酒酵母的混合发酵，生产出多酶系、高蛋白、高酶活的饲用酶制剂。
1·材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
黑曲霉、淀粉液化芽孢杆菌、啤酒酵母，河北经贸大学生物科学与工程学院保藏。
1.1.2培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl 5，琼脂20。pH 7.0，0.1 MPa灭菌20 min。查氏培养基（g/L）：蔗糖30，NaNO3 3，K2HPO4 1，KCl 0.5，MgSO4 0.5，FeSO4 0.01，琼脂20，自然pH，0.1 MPa灭菌20 min。
固态发酵培养基：豆粕30%，麸皮30%，啤酒糟40%，尿素0.60%，硫酸铵0.60%，KH2PO4 1.0%，MgSO·47 H2O 0.05%，初始料∶水＝1∶1.4，pH 5.0，0.1 MPa灭菌30 min。250 mL三角瓶装料量为10 g。
优化发酵培养基：豆粕60%，麸皮20%，啤酒糟20%，尿素0.6%，MgSO·47 H2O 0.05%，硫酸铵0.60%，KH2PO4 1.0%，初始料∶水＝1∶1.6，初始pH 5.0（以上营养盐及水分的添加量均以固体干基总量计）。250 mL三角瓶装料量为10 g。
1.2培养方法
将菌株接到发酵培养基中，30℃培养。当培养16 h左右，物料表面呈现少量白色菌丝体时，需进行翻料，使物料松散。以后每隔8 h进行翻料，直至发酵结束。取发酵产物进行酶活检测。
1.3测定方法
蛋白酶测定采用福林试剂显色法[6]；纤维素酶测定采用CMC酶活测定法[7]。
2·结果与讨论
2.1初始料水比对发酵的影响
水是所有培养基的主要组成成分，也是微生物机体的重要组成成分。它除直接参加一些代谢外，又是进行代谢反应的内部介质[8]。尤其在固体培养基中，含水量的多少会影响菌体的代谢和产物的形成[9]。现以初始料与水比为1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0 5个水平考察初始水分对酶活的影响，结果见图1。
由图1可知，随着发酵基质中的含水量的增加，酶活力不断增加，蛋白酶和纤维素酶在初始料水比为1∶1.6时，酶活最高。故选择初始料水比为1∶1.6。
2.2培养基成分的确定
2.2.1有机碳源的选择
碳是构成微生物细胞结构和代谢产物中碳架及能量来源的重要营养物质。啤酒糟中富含大量的粗纤维类物质谷壳，添加到培养基中，可使培养基较疏松，有良好通透性，有利于菌种的生长。豆粕能为酵母等菌体生长提供氮源。分别选用豆粕、啤酒糟和麸皮不同比例混合作为培养基主要成分进行发酵。以每个锥形瓶10 g干物料计，进行实验，结果见表1。
由表1可知，在有机碳源的不同选择和配比中，配比(6)中蛋白酶酶活最高，配比（5）中纤维素酶酶活最高。综合考虑，选择配比(5)，即豆粕60%+啤酒糟20%+麸皮20%。
2.2.2尿素的添加量对发酵的影响（图2）
有资料表明，对于非蛋白氮源，尿素对酶活力及酵母生长都较为有利。故本实验选用尿素作为有机氮源考察其添加量对发酵产酶的影响，由图2可知，蛋白酶和纤维素酶酶活在尿素添加量为0.6%时最高，故选用尿素添加量为0.6%。
2.2.3无机离子的添加对发酵的影响
无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质。主要功用：（1）构成菌体成分；（2）作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性；（3）调节渗透压、pH值、氧化还原电位等；（4）作为自养菌的能源。无机元素对微生物生长的影响较为复杂，一般来说，当其盐类浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度时却能刺激生长。本实验通过添加质量浓度均为0.05%的不同金属离子，挑选能激活酶活并促进酵母生长的金属离子。结果见表2。
由表2可知，所选用金属离子中只有Mg2+对蛋白酶和纤维素酶都有一定的激活作用。其他几种离子均没有显著的效果。
2.3发酵条件优化
2.3.1接种顺序对发酵的影响
采用混株发酵就在于能够发挥菌株的协同作用，本实验采用不同的接种顺序、不同的间隔时间进行培养，来考察接种顺序对于发酵产酶的影响，结果见表3。
由表3可知，不同菌株间发酵早期在利用可发酵性营养物上存在竞争关系。最佳接种顺序为先接入霉菌再接入酵母和细菌；最佳间隔时间为18 h，此时蛋白酶、纤维素酶酶活均最高。过早接入由于霉菌生长优势较大，会影响酵母的生长。过晚接入不能及时有效发生协同作用。
2.3.2发酵温度对产酶的影响
温度的变化对发酵过程可以产生两方面的影响：一方面会影响微生物的生长繁殖、代谢以及培养基的溶解氧及传递速率、pH、粘度等；另一方面它还能改变菌体代谢产物的合成方向以及产物酶的稳定性等。在发酵工艺条件的优化中，务必通过实验寻找最适发酵温度，即既适宜于菌体生长又适合发酵代谢产物合成的温度。现以28、30、32、34、36℃5个温度进行发酵培养，观察其对酶活力的影响，结果见图3所示。
由图3可知，30℃进行培养时蛋白酶、纤维素酶相对酶活最高。
2.4发酵过程跟踪
30℃发酵，每隔4 h观察曲料状态，并取样测定，绘制发酵曲线。发酵20 h时，曲料开始长有白毛，32 h曲料全部变成白色。进行翻曲增加通氧。41 h后曲料部分开始变成淡灰色，少量孢子开始形成。44 h曲料全部变成黑色，轻轻摇动无孢子飞扬。48～54 h孢子不断增多，56 h曲料为黑色，轻轻摇动孢子大量飞扬呈雾状。如图4所示。
从图4可知，32 h后酶活开始大幅度提高，44～48 h达到顶峰，48 h后菌种进入衰亡期，酶活下降。故可以在48 h结束发酵，此时纤维素酶酶活、蛋白酶酶活分别为1 265、3 236 u/g干曲。本研究考虑到孢子不利于动物消化。在形成少量孢子且酶活相对较高的时间结束发酵。故定发酵周期为48 h。
[参考文献]
[1]张贺迎，武金霞，高国华.高活力饲用复合酶制剂的制备[J].河北师范大学学报（自然科学版），2003，27(3):30-32.
[2]陈曦，赵建国.混株发酵混合酒糟生产含酶蛋白饲料的研究[J].中国酿造，2006,(5):30-33.
[3]吴祖芳，翁佩芳．复合菌固态生物转化啤酒糟发酵条件优化的研究[J]．饲料工业，2002,23(5):32-34.
[4]邱雁临，等．啤酒糟复合酶活性蛋白饲料的研究[J].粮食与饲料工业，1997,(9):17-18.
[5]蔡俊，邱雁临.啤酒糟发酵生产蛋白饲料影响因子的研究[J].粮食与饲料工业，2000,(4):30-31.
[6]天津轻工业学院，等.工业发酵分析[M].北京:中国轻工业出版社,1980.
[7]诸葛健,王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京:中国轻工业出版社,1994.
[8]俞俊棠,等.生物工艺学[M].北京:化学工业出版社,2005.
[9]Gervais,P.Water activity:a fundamental parameter of metabolic
production by microorganisms[J].AppliedMicrobiology and Biotechnology,1990,33:72-75.
