利用脂肪酶进行酯类的水解反应
蔡明儒 吴和生 元智大学化学工程研究所
摘 要:酶是一种由胺基酸所构成具有催化功能的蛋白质分子，与传统化学工业触媒相比较，酶具有高度的反应专一性(reaction specificity)重要的优点，因此產品的纯度很高，使得生產程序分离及纯化部分较为简单，降低生產成本。而因为生物技术的改良及酶固定化技术的出现，使的生物触媒的重复利用率大幅的提升，所以使的酶得以更广泛的应用。
所以本研究藉由培养菌株Pseudomonas fluorescens CCRC 17015，所获得的细胞内解脂酶lipase进行酯类的水解反应，希望藉由不同反应条件的探讨，以得到
较高產率的產物。
吴和生 元智大学化学工程研究所教授
Tel：(03)463-8800EXT564
E-mail：cehswu@saturn.yzu.edu.tw
蔡明儒 元智大学化学工程研究所学生
1. 前言
近十五年来，因为基因工程、蛋白质工程、细胞融合及组织培养等技术的开发与成熟使的生物技术有了突破性的发展。且由於现今的社会与政府皆注重於环境的保护与能源的节约，使得生物技术的发展相形地重要，因此生物技术被政府列为台湾未来发展的重点项目之一。而酶的研究与发展，更被视
为重点项目之一。
有鑑於此本研究选出在各方面皆有广泛应用的解脂酶(lipase)来进行研究。其在商业化的生物技术中其主要使用在清洁剂的添加、食物成分的製造、纸浆和造纸工业的树脂控制和具有立体选择转化作用的生物催化剂上。本文内容将针对此酶藉由不同反应条
件的改变做其探讨。
2. 解脂酶的简介和其作用机制
解脂酶系统命名为Acylglycerol hydrolase，酶编码则为EC 3.1.1.3。其主要是藉由许多的细菌和真菌加入培养基内所分泌出来，能催化有长链三甘油醯基(acylglycerol)的水解和合成反应，如图一所示。其与蛋白水解酶、淀粉水解酶同为一般生物体内重要的三
种水解酶。
图一、解脂酶的作用机制
解脂酶的催化作用通常伴随著高特定选择和高镜像选择性。这个理由使得解脂酶在有机化学裡成为一种重要的生物酶。而使的其在生物技术上拥有巨大发展潜力的原因则是：(1)其在有机溶液是稳定的；(2)不需要辅因子(Cofactors)；(3)拥有大范围的受质特
异性；(4)拥有高镜像选择性。
解脂酶为水溶性酶，但其基质为非水溶性的三甘油醯酯，因此催化反应主要是发生在亲水和疏水两相间的介面。在低基质浓度时，其酶活性很低，当基质浓度超过其临界胶体浓度(Critical micellar concentration)时，酶活性会急遽增加，显示出解脂酶的动力学并不遵循Michaelis-Menten方程式，且其活性是受到油水介面的影响，即为一般所谓的介面活性化现象。此现象可以由酶三级结构改变的角度来
解释。
3. 材料与设备
3.1 材料
Pseudomonas fluorescens CCRC 17015购自新竹食品工业发研究所。Tryptic soy agar购自Difco。Borth medium购自Sigma。Tributyrin购自
Fluka。其於药品则购自Riedel-deHaën
3.2 设备
高效率气相层析分析仪：shimadzu GC-14B；固定相(column)：125-7032 DB-WAX。高速冷冻离心机：SANYO
MSB080.CR1.H。
4. 实验方法
4.1 菌体培养与保存方法
使用的培养基为Tryptic soy agar和Broth medium。将菌种涂佈在含有固态培养基的培养皿上，於恒温培养箱30℃下，培养24小时。再将菌落接种至含有100ml液态培养基的培养瓶中於恒温振动培养箱中以30℃，转速200rpm，培养24小时。而菌体保存则是取液态培养基中培养20小时的菌液，与甘油以1：1的比例(各0.5ml)，置入1.5ml的无菌离心管中，以-20℃保
存。
4.2 酶的收集方法
将培养完成之菌液装入离心管中，
用高速冷冻离心机离心，离心条件为：4℃、2000rpm、8min。然后倒掉上层液体。加入的磷酸缓冲液(pH=7)混合均匀、重复上述步骤，可得乾净菌体。再将乾净菌体与磷酸缓冲液(pH=7)混合均匀於4℃下利用超音波将菌体打破。最后将打破后之菌液离心，离心条件为：4℃、6000rpm、8min。收集离心管
之上清液，即为酶液。
4.3 不同pH值对酶之影响
配製pH分别为6.5、7、7.5、8、8.5之25ml的磷酸酶缓冲液并加入25g的Tributyrin(1g/ml)，於30℃、200rpm下反应，每小时取样做GC分
析。
4.4 不同温度下对酶之影响
配製pH=7之25ml磷酸酶缓冲液再加入25g的Tributyrin(1g/ml)，分别於20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，200rpm
下反应，每小时取样做GC分析。
4.5 不同基质浓度下对酶之影响
配製pH=7之磷酸酶缓冲液25ml、50ml、100ml再分别加入25g、5g、5g的Tributyrin(1g/ml，0.1g/ml，0.05g/ml)，於30℃，400rpm下反应，
每小时取样做GC分析。
5. 结果与讨论
图二为不同pH值对解脂酶的活性影响，由图二中可得知，自由酶在pH＝7.5时有较佳的活性表现。此外，本实验是一种水解反应，Tributyrin的水解產生丁酸会使反应环境变酸，因此若酶置於低pH值的酸性环境中，可发现在越酸的情况下，酶失活的程度越严
重。
图三为不同反应温度对解脂酶之活性影响，一般而言，提高反应温度，能加快反应速率，但在酶反应系统中，高温会引起酶的构形改变，导致酶的失活，所以使反应速率增加并把酶失活的影响降到最低是将提高温度所需考虑的两大因素。而由图三中得知，酶在温度为30℃时有较佳的活性表现，所以推测酶在温度为30℃时，活性的提高是因为反应速率的增
加。
实验结果中发现，不同Tributyrin起始浓度在酶催化的系统中会影响生成物的產率，结果如图四所示。实验发现Tributyrin起始浓度越高，其產率越低。在高Tributyrin起始浓度时，產率无法推高到90%以上，推测可能原因可能是反应过程中丁酸的產生会造成反应环境的酸化，导致酶的失活而无法继
续进行催化水解反应。
6. 结论
由实验结果可知，菌株Pseudomonas fluorescens CCRC 17015所生產的细胞内酶lipase，对反应基质Tributyrin有不错的水解反应能力。但是水解的同时会產生丁酸，使得酶的活性降低。应此未来的方向除了继续寻找最适的反应条件，希望藉此提高酶反应时的活性和稳定性。并藉由反应活性的提高，缩短反应的时间，避免副反应的发生。并可以将酶尝试固定於担体颗粒上，如此不但可以增加耐热性和耐酸硷性，更可以避免酶容易失活(保存及操作时的不稳定性)和不易回收重复使用(酶为水溶性，不易与產物分离)的缺点，并藉此增加酶的重覆使
用率。
.GIF)
7. 参考文献
(1) 刘英俊、汪金追、刘裕国，“最新微生应用工业”，中央图书出版社，第四版，台北(1996)
(2) 林家立，“酶催化不对称反应”，化学，55：P59，1997
(3) Gilbert E. J., Pseudomonas lipases biochemical properties andmolecular cloning, Enzyme Microb. Technol.,15：P.634-645, 1993
(4) Jaeger, K-E. ,Ransan , S. ,Dijkstra ,B. W. ,Colson ,C. ,van Heuvel ,M.and Misset ,O.(1994) FEMS Microbiol.
Rev. 15,29-63.
(5) 李莲兹，伊福秀，“光学活性药物製备技巧漫谈” ，化工技术，5：
P205-212，1997
