夏服宝 邱雁临 孙宪迅
摘 要 用DNS法测定纤维素酶活力，分析测定条件对测定结果的影响。在不同的条件下测定酶活力会得到不同的纤维素酶活力测定值。其中，酶液用量、酶解反应时间、温度对测定结果影响较大，酶液的稀释度、DNS显色时间对测定结果也有一定影响。测定纤维素酶活力的最适条件为：酶解反应时间为30min,最适温度40℃，DNS用量2.5ml，显色时间5min。
关键词 纤维素酶；酶活力；测定条件
中图分类号 S816.17
Studies on Condition for Determination of Cellulase Activity
Xia Fubao, Qiu Yanlin, Sun Xianxun
Abstract The purpose of this study is analyzing the effects of determination conditions on results of measurements of by the DNS method. On different conditions, the results of the measurements of cellulase activity are different. Among these conditions, the concentration of cellulase, reactions time and temperature have great effects on the results. The optimum conditions for determination of cellulase activity: 30min for enzymatic reaction;optimum temperature 40℃，the quantity of DNS is 2.5ml and 5min for cloring.
Key words cellulase；cellulase activity；determination
纤维素酶是一种复合酶，多组分协同作用完成纤维素的降解[1]。纤维素是地球上最丰富的可再生资源。生物降解纤维素是减少粮食短缺和缓解能源危机及减轻环境污染的根本措施之一[2]。因此，近年来在食品工业、饲料工业生产及环保中都有较大的应用价值[3]。酶活力是衡量酶生物活性的重要指标，不同的测定条件，对酶活力的最终测定结果有一定影响。为了选择适宜的酶活力测定条件，提高测定结果的准确性，本文根据有关资料所采用的测定条件，对酶活力测定中的几个主要影响因素进行了研究。
1 标准曲线的绘制
1.1 材料与方法
1.1.1 药品与试剂
1.1.1.1 葡萄糖
葡萄糖为分析纯。
1.1.1.2 二硝基水杨酸（DNS）
称取酒石酸甲钠91g溶于500ml的水中，在溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸3.15g，氢氧化钠20g，加热搅拌使之溶解，再加入重蒸酚2.5g，无水亚硫酸钠2.5g，搅拌使之溶解，冷却后定容至1L，贮于棕色瓶中，放置1周后使用。
1.1.2 主要仪器
GW-722型可见分光光度计，由上海精密仪器有限公司提供；TG-328A光学读数分析天平，由湘仪天平仪器厂提供；电热恒温水浴锅GSY- 1，由北京市医疗设备厂提供。
1.1.3 试验方法
1.1.3.1 500μg/ml标准葡萄糖溶液
称取在105℃干燥2h的分析葡萄糖0.5g，加水溶解，稀释定容到1L。
1.1.3.2 标准曲线的绘制
取大试管7支，编号，用吸管准确吸取500μg/ml标准葡萄糖溶液与蒸馏水混匀，配成7种不同浓度的标准葡萄糖液，浓度分别为80、120、160、200、240、280、320μg/ml。
另取试管7支，编号，用吸管分别吸取上述试管中各种浓度的标准葡萄糖溶液，使2.5ml溶液中分别含葡萄糖为160、180、200、220、240、280、320μg （0管内加入2.5ml蒸馏水），然后于各试管中加入2.5ml DNS试剂，摇匀，置于沸水中煮沸5min。取出置于冷水浴中冷却，在722型分光光度计上比色。选用520nm的波长及0.5cm厚的比色杯，以管内的溶液作比较，测各管内的光吸收度A值。以2.5ml标准葡萄糖液中所含的葡萄糖的微克数为纵坐标，以光吸收度A为横坐标，做出葡萄糖的标准曲线。
1.2 结果与分析
标准曲线的绘制见图1。
如图1所示，葡萄糖标准曲线是一条不通过原点的直线，它是计算纤维素酶活力单位的标准。
2 纤维素酶酶活测定方法
由于纤维素酶没有统一的测定方法，酶活力定义也没有统一标准，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。为选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，根据有关资料中采用的测定条件，对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。
2.1 材料与方法
2.1.1 纤维素酶酶液制备[4，5]
取在适宜条件下培养的发酵粗酶粉10g加200ml水，搅拌，于水浴40℃中保温45min，用脱脂棉过滤入离心管中，以3 000r/min离心5min，取上清液,用旋转蒸发器在40℃抽真空浓缩。
2.1.2 主要仪器
GW-722型可见分光光度计（上海精密仪器有限公司）；CS501型超级恒温器（重庆实验设备厂）；TG-328A光学读数分析天平（湘仪天平仪器厂）；电热恒温水浴锅GSY- 1（北京市医疗设备厂）。
2.1.3 酶活测定的方法[6-8]
2.1.3.1 酶反应的速度曲线
取稀释酶液0.5ml与pH值4.8的CMC（羧甲基纤维素）缓冲液2.0ml混匀，在40℃恒温水浴锅中糖化不同的时间，取出后加入DNS试剂2.5ml于沸水浴中显色5min之后在冷水中冷却至室温，测吸光度A。
2.1.3.2 酶活测定所用波长（λ）选择
取不同浓度的纤维素酶稀释液0.5ml，加入2.0ml CMC缓冲液，在40℃恒温水浴锅中反应30min，取出后加入2.5ml DNS试剂于沸水浴中显色5min, 放于冷水中冷却至室温,测定还原糖在不同的波长下的吸光度A。
2.1.3.3 底物浓度对酶活测定的影响
需要配置的底物质量浓度分别为0.210％、0.420％、0.625％、0.938％、1.250％。取pH值4.8的CMC缓冲液2.0ml分别与稀释酶液0.5ml 混匀，在40℃恒温水浴锅中糖化30min后取出，加入DNS试剂2.5ml于沸水浴中显色不同的时间后取出，冷水中冷却至室温，测定吸光度A。
2.1.3.4 酶液稀释度对酶活测定的影响
浓缩液稀释250倍后，再以不同倍数（2、3、4、5、6、7、8、9、10）稀释。分别取0.5ml稀释酶液, 加入pH值4.8的CMC缓冲液2.0ml，在40℃恒温水浴锅中糖化30min后取出，加入DNS试剂2.5ml于沸水浴中显色5min后，在冷水中冷却至室温，测定吸光度A。
2.1.3.5 温度对酶活测定的影响
取稀释酶液0.5ml与pH值4.8的CMC缓冲液2.0ml混匀，在不同温度的恒温水浴锅中糖化30min后取出，加入DNS试剂2.5ml于沸水浴中显色5min后,冷水中冷却至室温，测定吸光度A。
2.1.3.6 显色时间对酶活测定的影响
取稀释酶液0.5ml与pH值4.8的CMC缓冲液2.0ml混匀，在40℃恒温水浴锅中糖化30min后取出，加入DNS试剂2.5ml于沸水浴中显色不同的时间后取出，冷水中冷却至室温，测定吸光度A（见表1）。
2.2 结果与分析
2.2.1 酶反应的速度曲线 [9-12] （见图2）
由于3，5-二硝基水杨酸是一种氧化剂，能与还原糖作用，使硝基还原成氨基，溶液变为橙色，在一定还原糖的浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比。因此可采用比色法求得还原糖的浓度，产生的葡萄糖的含量与所测的吸光度A成正比。由图2可见，反应时间为30min时，酶反应速度达到最大。
2.2.2 测定波长（λ）的选择[13-15] （见表2）
比较上表数据可见，当采用吸收波长为520nm, 在相同水平下所测吸光度A最大，所以以下试验采用测定波长为520nm。
2.2.3 底物浓度对测定酶活的影响（见表3）
可见，底物浓度对测定结果有一定的影响，而且符合酶反应动力学原理，即当底物浓度较低时，酶反应速度与底物浓度的关系呈正比关系，从0.21％~0.625％，随着底物浓度增加，酶活力增加，当底物浓度过高时，即大于0.625％时，由于高浓度底物对酶促反应起抑制作用，使酶活力下降。
2.2.4 酶液稀释度对酶活测定的影响（见表4）
由表4结果可见，稀释度的改变，会明显改变酶活力测定的结果。在一定范围内稀释度大，结果偏高，稀释度小，结果偏低，但是稀释度过大，结果也偏低。由表中数据可见，吸光度A控制在0.3～0.7所测酶活力值较稳定。
2.2.5 反应温度对酶活测定的影响[16，17] （见表5）
由表5可见，40℃所测酶活力为最高，即40℃是此酶的最适酶解温度。
2.2.6 显色时间对酶活测定的影响（见表6）
由表6可见，显色时间对测定结果有较大影响，显色时间越长，测定值越大；显色时间在0~3min内测定值变化有明显差异，显色时间在3~9min内无明显变化，但是在此时间段所测的酶活比在0~3min内的所测值高约4.8％，一般选用显色时间为5min。
3 结论
酶活力是指在一定条件下，酶所催化反应的速度。在实际测定中，测定的结果与所采用的各项测定条件有关，采用不同的测定条件，会得出不同的结果。
由测定结果可见，在一定的温度条件下，一定酶液用量和酶反应时间对测定结果的影响较大，酶液稀释度和DNS显色时间对测定结果也有一定的影响。其中：①酶液用量与底物浓度的影响都遵循反应动力学原理。在底物浓度较低时，酶反应速度与底物浓度的增加成正比关系；底物浓度过高时，由于高浓度底物的抑制作用，酶反应速度反而会下降。②酶解反应时间的选择。由酶反应速度曲线可见，反应速度随着反应时间的延长，酶反应速度下降。这主要是因为随着反应进行，底物浓度降低，产物浓度增加，从而加速了逆反应的进行。因此，为准确地表示酶活力，需采用初速度来表示，试验结果证明酶解时间为30min为宜。③酶液稀释度的选择应根据标准曲线，将吸光度A控制在0.3~0.7的范围内。④显色时间控制为5min，可得到较稳定的测定值。⑤酶解温度宜选用酶反应的最适温度40℃。
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夏服宝，湖北工业大学生物工程学院，实验师，430068，湖北武汉。
邱雁临、孙宪迅，单位及通讯地址同第一作者。
收稿日期：2005-02-25
