pNPG法测定纤维素酶系中β－葡萄糖苷酶

黑龙江医药科学 2000年第1期第23卷 技术与方法
作者：李春江　邢淑梅　孙蕾
单位：李春江(佳木斯大学基础医学院)；邢淑梅(绥滨县大同乡卫生所)；孙蕾(佳木斯市中心医院)
关键词：β－葡萄糖苷酶；酶活；测定
　　以对硝基酚－β－葡萄糖苷(pNPG)为底物测定纤维素酶活力，目前，没有一个统一的标准，很难比较文献中的酶活力大小。本文通过试验，以期探讨一个共同的标准。

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　　1 材料与方法
　　试剂：pNPG. Sigma公司，水杨酸Boyer进口分装。缓冲液及其它溶液：0.2mol/L n₂HPO₄-0.1mol/L柠檬酸缓冲液pH 3.0～7.5(间隔0.5)；1mol/L na₂CO₃溶液，pNPG溶液：0.05，0.1，0.25，0.5，0.75，1，2.5，5，7.5mmol/L。菌种：无花果曲霉101；上海工业微生物研究所菌种站提供。方法：采用3,5一二硝基水杨酸(DNS)比色法^[1]。
　　2 结果与讨论
　　2.1 β－葡萄糖苷酶活力的测定
　　由于pNPG试剂国内没有生产，因此国内测该酶活力通常用DNS比色法，而国外用pNPG为底物测酶活力方法中条件各不一样。而且酶的来源不同，其酸、碱及温度适应性就不同，酶活力测定条件就有差异。
　　2.1.1 缓冲液pH
　　用0.2/L Na₂HPO₄-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，试验pH4～6范围内酶活力的最高点，得到最佳pH为4.5。
　　2.1.2 底物浓度
　　根据Henri研究^[2]，低底物浓度时，并非所有的酶分子都能与底物相结合，随着底物浓度的增加，愈来愈多的酶分子与底物相结合，最后，直到所有分子都与底物相结合，此时，进一步增加底物浓度也不能提高反应速度，速度达到最高值。试验了不同底物浓度(1～10mmol/L)对反应速度的影响，浓度在0～2mmol/L时，随着底物浓度的增加，反应速度直线上升，浓度达到5mmol/L时，速度至最高值，再提高浓度，速度不再增加。因此，测酶活力时，底物浓度可取5mmol/L。
　　2.1.3 反应时间和反应温度
　　当反应时间为5min时，在反应温度为30℃～60℃范围内，反应速度随着温度的升高而呈直线上升，当反应进行至10min，在60℃的反应温度时，反应速度有所下降；当反应进行到15min时，55℃时，反应速度已经开始下降。测酶活力时，希望反应速度较大，而3,5一二硝基水杨酸比色法测酶活力时，反应温度为50℃，为了与此法有可比性，反应温度取50℃，时间10min。
　　2.1.4 最大吸收峰
　　验证了最大吸收峰在410nm处。综上所述，得到酶活力测定方法如下：取0.1ml适度稀释的酶液，加入0.9ml pH4.5的0.2mol/L Na₂HPO₄-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，50℃水浴预热10min，再加入预热10min的5mmol/L pHPG溶液1ml，计时，10min后立即加入1ml 1mol/L Na₂O₃溶液终止反应，室温放置5min，410nm处测消光值OD。以加热失活的酶液按照同样方法处理作空白。酶活单位定义：每min每ml酶液水解1μmolpNPG的酶活力为一个酶活单位u。
　　2.2 与3,5一二硝基水杨酸(DNS)比色法相对比
　　用两种方法分别测定无花果曲霉β－葡萄糖苷酶活力，以pNPG为底物用作者得到的最佳条件测得的酶活为12.54u/ml，而以水杨酸为底物，DNS比色法得到的酶活力为9.30u/ml，两者之比100:74.2。根据文献报道^[3]，一般β－葡萄糖苷酶对pNPG及水杨酸的水解活力为100:70，两者数值相符。因此，本方法是可行的。
　　本文所述方法在测定无花果曲霉β－葡萄糖苷酶时得到的，采用此方法测定β－葡萄糖苷酶活力，不受纤维素酶系中其它组分影响，得到的酶活力完全反映β－葡萄糖苷酶的活力，而且此方法简便快速，非常适合于大批量筛选菌种时采用。作者运用此法成功地选育出β－葡萄糖苷酶高产菌株，为课题的进一步深入奠定了基础。
　　参考文献
　　1，蔡武城,袁厚积编.生物物质常用化学分析法.北京:科学出版社,1982
　　2，王璋编著.食品酶学.北京:轻工业出版社,1990
　　3，Bruce Eberhart J Bacterlology,1964,87(4):761～770
(收稿：1999-10-01)