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无机盐对饲料酶活性影响的研究

   日期:2013-02-03     来源:酶制剂网    
核心提示:本文主要研究了几种无机盐对纤维素酶和木聚糖酶酶活力的影响,以期为酶制剂的稳定性研究及在饲料工业中的应用提供参考。
本文主要研究了几种无机盐对纤维素酶和木聚糖酶酶活力的影响,以期为酶制剂的稳定性研究及在饲料工业中的应用提供参考。
1材料与方法
1.1试验仪器移液枪及枪头、微样进注器、刻度吸管、分析天平(精确度±0.0001 g)、恒温水浴锅(37~100℃)、分光光度计(uV一751GD型,紫外一可见光分光光度计)、pHS一3c pH计(精度±0.01)、冰箱(4℃)、磁力搅拌器、计时器、自动平衡微型离心机。
1.2试验材料纤维素酶和木聚糖酶,均为黄褐色粉末状,溶于水,由湖南尤特尔生化有限公司生产并提供。
1.3试验试剂 柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(pH值4.8,纤维素酶)、碳酸氢钠一碳酸钠缓冲液(pH值6.5,木聚糖酶)、DNS试剂(由分析纯的3,5一二硝基水杨酸、氢氧化钠及酒石酸钠钾配制而成)、0.1%葡萄糖标准液、0.1%木糖标准液。
1.4试验设计将无机盐与酶样分别以1:10和1:2混合均匀,取样配制成待测酶液,测定酶活力。 1.5酶活力测定 1.5.1测定方法。采用3,5一二硝基水杨酸法(简称DNS法)(高雯等,1991)。
1.5.2酶活力单位定义。纤维素酶:在50℃、pH值4.8条件下,1 min分解底物产生1umol产物所需的酶量为1个国际单位。木聚糖酶:在50℃、 pH值6.5条件下,1 min分解底物产生1umol产物所需的酶量为1个国际单位。
1.5.3测定底物。1.0%羧甲基纤维素钠盐(简称 CMC-Na)(pH值为4.8±0.05)、1.0%燕麦木聚糖(pH值为6.5±0.05),均系荷兰SIGMA公司生产。
1.5.4待测酶液的制备。分别称取l g纤维素酶和木聚糠酶(准确到0.0001 g)样品,用相应的缓冲液溶解并逐步稀释至4500倍(纤维素酶)和30000倍(木聚糖酶)。
1. 5.5绘制标准曲线。取6支编号试管,用微样进注器,分别加入相应底物和缓冲液各500 uL,以及按编号由l~6分别加入0.1%葡萄糖标准液(纤维素酶)或木糖标准液(木聚糖酶)O、1、20、25、30、35 uL,再于每管中加入3 mL DNS试剂,充分混匀后置沸水中水浴5 min,再经冷水冷却5 min,以第1号试管为对照,在540 nm下测光密度,再以光密度作为纵座标,葡萄糖终含量(纤维素酶)或木糖终含量(木聚糖酶)作为横座标绘制标准曲线。
1.5.6酶活力测定。取0.5 mL底物于两支试管中,与待测酶液一起置于50℃水浴中,预热5 min。取0.5 mL待测酶液依次定时加入到底物中,水浴15 min,冷却5 mm,于540 nm下读取吸光值。查相应标准曲线,计算酶活力(Iu/g)。酶活力(Iu/g)=[葡萄糖等量值(纤维素酶)或木糖等量值(木聚糖酶)/180/15/0 5]×n(n为稀释倍数) 2结果与分析 无机盐对纤维素酶及木聚糖酶酶活力的影响分别见表1。处理前,纤维素酶活力为1000 IU/g,木聚糖酶为5000 Iu/g。
表l 1:10和1:2添加无机盐后对纤维素酶、木聚糖酶活力的影响 Iug

 

纤维素酶活力 木聚糖酶活力
添加无机盐 1:10 1:2 1:10 1:2
NaCI 1005 1005 524I 5318
KI 1001 1001 5012 50/8
CuCl2.2H2O 957 902 1937 1798
MgCl2.6HgO 1000 1048 4446 4248
ZnS04.7H2O 1052 1084 4480 4261
MnCL24H2O 1225 1435 4546 4359
KH2Po4 996 1036 5313 5336
CaCl2 1001 1069 5202 5381
FeCl3 1007 1160 4407 4211

2.1 对纤维素酶酶活力影响

 

由表1可以看出,以1:10添加无机盐ZnSO4、MnCl2对纤维素酶有激活作用,其中MnCl2的激活作用最明显,可使酶活提高22.5%,其次是 ZnSO4,提高酶活5.2%。以1:10添加NaCI、FeCl3、KI和CaCl2,虽然纤维素酶酶活力有所提高,但提高的幅度很小,分别为0. 5%、0.1%、0.1%,其激活效果不明显;MgCl2对酶活无影响,而CuCl2则对酶活起抑制作用,使酶活降低了4.3%。

 

由表1可以看出,MgCl2,ZnSO4,,MnCI2KH2PO4、 CuCl2,FeCl3随着添加比例的增加,对酶的激活或抑制作用更加明显,其中MnCl2可使酶活提高43.5%。以1:10添加对酶活基本无影响的 MgCl2、 KH2P04和CaCl2随着离子浓度的增加,对酶的激活作用也分别上升至4.8%、3.6%和6.9%。添加 NaCl和KI对纤维素酶的激活作用并未随离子浓度的增加而加强。CuCl2随着离子浓度的升高对纤维素酶活性的抑制作用也由原来的4.3%上升至9. 8%,其抑制作用更加明显。从KH2PO4及其添加比例与其酶活变化情况来看,一定浓度的KH2PO4对纤维素酶具有激活作用。但从KI的添加情况来看,纤维素酶活力并未随其离子浓度的变化而变化,而是趋于稳定。造成这种情况的原因可能是I一对纤维素具有一定的抑制作用,也可能是KH2PO4中对纤维素酶起激活作用的是H2PO4,而不是 K+,但具体是哪一种原因,还有待进一步研究。

 

2.2对木聚糖酶酶活力影响

 

结合表1可以看出,NaCl、Kl、KH2PO4、CaCl2对木聚糖酶具有激活作用,其他无机盐对木聚糖酶均起抑制作用,特别是 CuCl2,低浓度的CuCl2可使木聚糖酶活性降低61.26%。随着CuCl2浓度的增加,木聚糖酶失活现象越严重,可高达64.04%。在酶与底物作用之前,可以看到酶液中有蓝色絮状沉淀,待测酶液与底物反应并加入DNS试剂以后,溶液变成深蓝色沉淀。究其原因可能是Cu>与木聚糖酶的必需基团结合或与之发生反应,从而造成了木聚糖酶失活。另外,MgCl2、MnCl2、ZnS04、FeCl3对木聚糖酶均具有不同程度的抑制作用,且其抑制作用随其离子浓度的增加而有不同程度的加强。NaCl、KI、 KH2P04、CaCl2对木聚糖酶具有一定的激活作用,但NaCl的激活作用保持4.3%左右,而CaClz的激活作用随着无机盐浓度的增加而有所增强。

 

3结论

 

通过本试验可以看出,无机盐对纤维素酶具有不同程度的影响,其中NaCl、KI、MgCl2、ZnS04、 MnCl2、KH2PO4、FeCl3、CaCI2对纤维素酶起激活作用,其作用程度除NaCl、KI以外均随其浓度的增加而有不同程度的加强。在本次试验没计的条件下,MnCl2的激活效果虽显著,其他无机盐的激活作用由大到小依次为FeCl3、ZnSO4、CaCl2、MgCl2、 KHzPO4、NaCl。CuCl2对其起抑制作用。

 

无机盐对木聚糖酶也有不同程度的影响, NaCl、KI、KH2PO4、CaCI2对木聚糖酶具有激活作用,作用程度随着离子浓度的增加而有所增强。 CuCl2、MgCl2、MnCl2、ZnSO4、FeCl3均对木聚糖酶起抑制作用,其抑制作用随离子浓度的增加而有所增强。在本次试验设计的条件下, CuCl2的抑制作用最明显,其他无机盐的抑制作用由大到小分别为MgCl2、ZnSO4、MnCl2。
 
 
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