基因工程常用的工具酶

1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。

2．类型：来自原核生物，有三种类型。

Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。

Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。

Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。

三种限制酶的区别如下表所示：

3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序。如HindⅢ是来自Haemophilus influenzae D（嗜血流感杆菌D株第三种限制酶）。

4．切割位点和结果：限制酶位点在DNA链上是随机分布的，若识别位点为4bp，则4⁴（256）个核苷酸可遇一个切点。若为6bp，则平均4⁶（4096）个核苷酸才遇到一个切点。限制酶沿回文结构的对称轴切开，则产生平头末端（flush or blunt ends）如BalⅠ。多数限制酶错位切开dsDNA，产生5′ or 3′-单链互补顺序，称为5′ or 3′-粘性末端（sticky or cohesive ends），如HindⅢ、PstI。

5．反应条件：

限制酶酶切反应的影响因素如下：

（1）DNA的纯度 限制酶消化DNA的反应效率，在很大程度上取决于所使用的DNA本身的纯度。提取DNA时，蛋白质、RNA、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高盐等都有可能抑制限制酶的活性。小量制备的DNA尤其会遇到这种问题。RNA一般不影响酶的反应速度，但它能和蛋白质发生非特异性结合，从而减少酶的有效浓度。

少量蛋白质污染不影响酶活性，但如果是Dnase污染则会导致DNA的降解，它可能来源于溶解DNA的试剂溶液或者酶解缓冲液的组分。由于Dnase的活性需要有Mg²⁺的存在，而在DNA的储存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，一般用1mmol/L EDTA溶液（TE）溶解DNA，在保存DNA的过程中因为是低温，Dnase不会有活性，一旦将DNA加入反应体系，EDTA的浓度降低，在37℃温度下反应时，Dnase的活性就会发挥出来。混杂的结合蛋白则与DNA结合，不仅会封闭酶的识别序列影响酶解，而且形成的DNA—蛋白复合物将干扰DNA的电泳行为。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。为了提高限制酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下4种措施：

②增加酶反应体系的体积，以使潜在的抑制物被相应的稀释。

③延长酶解反应的保温时间。

④向反应体系中添加亚精胺（spermidine）（终浓度为1~2.5mmol/L），亚精胺与负电性的杂质结合。注意，亚精胺在4℃时会沉淀DNA，因此最好在反应已经保温数分钟后再加入。

DNA本身如果降解了，便无法挽救。但有时DNA纯度很好，不存在上面所述的问题，酶解效果不好就可能有两种原因，一是DNA没有溶解充分，加入反应体系的DNA比计算的量多得多，使反应体系粘度太大，影响了酶分子的扩散或酶用量相对不足；二是DNA用量虽不过量但由于混合不均匀，也会影响酶解效果。

（2）识别序列的甲基化程度限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此，识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈影响酶的活性。通常从大肠杆菌宿主细胞中分离出的质粒DNA，都混有dam甲基化酶及dcm甲基化酶，前者催化GATC序列中的A甲基化；后者催化CCA/TGG序列中的C甲基化。因此，在基因克隆中要使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。

（3）酶切反应的温度不同的限制酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数限制酶的最适温度在37℃，但有许多例外的情况，如SmaⅠ是25℃；MaeⅠ45℃、BclⅠ50℃、MaeⅢ55℃、BstⅡ60℃、TaqⅠ65℃等等。

（4）DNA的分子结构 DNA分子的不同构型对限制酶的活性也有很大影响。某些限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA高出许多倍，最高可达20倍。还有一些限制酶切割不同部位的酶切位点，其效率有明显的差别。

（5）酶解缓冲液各组分的影响 使用不适宜的酶解缓冲液，常是导致酶解效果不好的原因。缓冲液要新鲜配制，各种离子及其浓度要准确，pH要调准。在反应条件不恰当时，某些限制酶会出现“星号”活性，即它们不再严格遵循从识别序列酶解DNA，而会在其他的序列切断DNA，如EcoRⅠ，其“星号”活性表现在它自AATT序列处切断DNA。

Tris-HCl缓冲液是比较理想的限制酶反应缓冲体系，在pH7.4~8.0有较大的缓冲容量。

Mg²⁺是酶的激活剂，终浓度一般需在5mmol/L以上，如果反应体系中存在螯合剂（如EDTA和枸橼酸），游离Mg²⁺的浓度会减少，使酶活性下降。当Mg²⁺被其他二价金属离子（如Mn²⁺、Co²⁺或Zn²⁺）取代时，不仅会影响酶的活性还会改变酶的识别特异性。

反应体系中的NaCl仅提供一定的离子强度。不同的酶要求不同的NaCl浓度。个别的酶需要其他的离子，如SmaⅠ绝对需要K⁺，PstⅠ更易被NH⁺₄激活。

大部分缓冲体系中含二巯基乙醇（BSH，1~10mmol/L）或二硫苏糖醇（DTT，1mmol/L）。加入巯基化合物的目的是为了去除一些能与巯基去反应的化合物对酶的抑制。但不是所有的酶都需要添加巯基化合物，如EcoRⅠ、HindⅢ等；而BamHⅠ、AvaⅠ、PvuⅡ和SmaⅠ非要巯基化合物不可。不需要者可省去，需要者则应新鲜配制。

反应体系中的牛血清白蛋白（BSA）或白明胶是用来稳定酶活性的。当反应体系中蛋白浓度低于20ug/μl时，有些酶就会极不稳定。加入BSA后，不仅可减少蛋白的降解，而且还能减轻非特异吸附造成的酶蛋白丢失。但所用的BSA纯度较高，不含Dnase。用白明胶可代替BSA。但过量的BSA也会与DNA结合而影响DNA的电泳分离。

水的质量不容忽视，所用的水应该是无离子及有机化合物的玻璃器皿重蒸水，去离子水也能满足要求。

（6）酶活性限制酶的单位：在限定条件下，1小时消化1μg DNA所需的酶量为1单位。这是最为重要的。比活较低的酶，因加入的酶溶液体积大，常有甘油浓度太高的问题，为了避免甘油浓度高于5%，反应体系体积较大，对下步的电泳操作带来不便。此外，某些酶由于保存时间长，活性降低（以至失活），或者反复取用受到污染或暴露于室温时间太久，也会导致酶活性降低。因此在进行重要样品酶解前最好测定酶活性的强弱，以免损失样品。

三、T₄ DNA连接酶（T₄ DNA ligase）

从T₄噬菌体感染的大肠杆菌中分离的。能催化两个DNA片段的3′-OH和5′-磷酸形成3′,.5′-磷酸二酯键，将两个片段连接成为一个共价结合的DNA分子。

四、逆转录酶（reverse transcriptase）

又称依赖RNA的DNA聚合酶（RNA dependent DNA polymerase，RDDP）。属于多功能性酶。

1．RDDP：以mRNA为模板，以带3′-OH的DNA片段为引物合成cDNA。

2．外切RNA酶活性：底物是RNA-DNA杂化分子中的RNA链。从RNA链5′-端外切者称为5′→3′ 外切RNA酶；从RNA链3′-端外切者称为3′→5′ 外切RNA酶，也称RNA酶H。

3．依赖DNA的DNA聚合酶：以单链DNA为模板，以带3′-OH的DNA片段为引物，从5′→3′ 方向合成dsDNA。