重组DNA技术中常用的工具酶

核酸酶分为两类：核酸外切酶(exonuclease)是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3'-5'磷酸二酯键，将核酸链切断。很多细菌和细胞都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是由于细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特异的核酸序列而将核酸切断；同时在细菌体内还伴有特定的核酸修饰酶，最常见的是甲基化酶(methlase),能使细胞自身核酸特定序列上的碱基甲基化，从而避免受内切酶水解，外来核酸没有这种特异的甲基化修饰，就会被细胞的核酸酶所水解。这样细胞就构成了限制-修饰体系(restriction modification system)，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维护自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性内切酶中“限制”二字概念的由来。

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限制性核酸内切酶是一类专门切割DNA的酶，它们能特异的结合一段被称为是限制性内切酶识别序列的DNA序列，并切割双链DNA。

限制性核酸内切酶可分为3种类型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖ATP的限制(切割)活性。

Ⅲ型限制酶在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离。

Ⅰ型限制酶的切割位点与识别位点不一致，它结合与识别位点，但却随机的切割回转到被结合酶处的DNA，在分子克隆中，Ⅰ型和Ⅲ型限制酶都不常用。

Ⅱ型限制-修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统：一种为限制酶，它识别和切割某一特异性的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。迄今人们已分离出大量的Ⅱ型限制酶，其中许多已应用于分子克隆中。这一节我们主要介绍Ⅱ型限制酶。每一种Ⅱ型限制酶的识别序列都有其特定的核苷酸序列，因此只要知道DNA的序列，就可以找出限制酶的识别位点，并可计算出酶切后DNA片段的长度(以核苷酸对或碱基对的数目表示)。

1.限制酶识别位点

(1)一般特征：Ⅱ型限制酶所识别的特殊的DNA序列亦称为限制酶识别位点或酶切位点，一般长度为4个、5个或6个核苷酸对，且成二重对称结构。

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有少数限制酶识别更长的序列或简并序列。

(2)简并序列：简并序列是指序列中有的核苷酸位点可以是不同的核苷酸。如，GTYRAC(HindⅡ)，其中Y=C或T，R=G或A,YR可以是CG、CA、TG或TA。所以HindⅡ实际上可识别4个特定的序列。

(3)与切割位点不同的识别位点：有些限制酶的切割位点是在识别位点的附近。如，Hgal的识别位点是GACGC(5/10)，在两条DNA链上切割位点分别距识别位点5个和10个核苷酸。

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2.限制酶的切割位点

限制酶在识别位点切割DNA时，其具体的切割位点(磷酸二酯键断开的位点)相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶刚好在对称轴处同时切断DNA的两条链，产生带平头末端的DNA片段；另一些酶则在对称轴两侧类似的位置分别切断两条链，产生带有单链突出的粘性末端的DNA片段。有6个核苷酸对组成的限制酶识别位点，不同的酶对各自位点切割时可以产生5种不同的断裂方式。

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3.同裂酶(isoschizomer) 

通常，不同的限制酶有不同的识别序列，然而有许多不同来源的限制酶切割DNA后产生相同的末端，这些酶就是同裂酶。同裂酶有3种类型。

(1)同功异源：不同来源的限制酶可以切割同一靶序列。如MboI和Sau3AⅠ均可以切割以下靶序列：

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(2)一个位点包含在另一个位点之中：一些酶识别4核苷酸序列，这种核苷酸序列包含在另一些酶的6核苷酸识别序列中。例如MboⅠ和Sau3AⅠ位点与BamHⅠ位点即具有这种特点。

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(3)两位点切割后的断裂末端相同：有些酶识别的完整序列不完全一样，但切割位点间的序列一样。如:

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末端相同，可交叉连接，这在DNA重组时是非常有用的。

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是由一条多肽链组成，分子量为109kD，具有三种活性，即5'-3'DNA聚合酶活性，5'-3'及3'-5'外切核酸酶活性，同时它还具有RNA酶H的活性。RNA酶H的活性是大肠杆菌细胞存在所必需的，但在分子克隆中未用到此活性。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ在分子生物学实验中常用于：1.缺口平移制作标记DNA探针；2.合成cDNA的第二链；3.填补双链DNA的3'凹端。

大肠杆菌DNA聚合酶I用枯草杆菌素(subtilin)处理后，可以产生大小不同的两个片段。其中大片段称为Klenow片段(由Klenow等人于1970年报道)。该片段仅具有5'-3'DNA聚合酶活性及3'-5'外切核酸酶活性。Klenow片段在分子生物学实验中常用于：1.补平限制酶切割DNA产生的5'突出的粘性末端；2.对5'突出的粘性末端进行末端标记；3.合成cDNA的第二链。

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T7噬菌体感染大肠杆菌诱生的DNA聚合酶是两种紧密结合的蛋白质的复合体，这两种蛋白质一个是T7噬菌体基因蛋白，另一个是宿主菌的硫氧环蛋白。这个复合物是所有已知DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个。T7噬菌体DNA聚合酶所催化合成的DNA的平均长度比其他DNA聚合酶催化合成的DNA的平均长度大很多，在DNA序列测定时具有很大的优势。T7噬菌体DNA聚合酶没有5'-3'外切核酸酶活性，但其3'-5'外切核酸酶活性非常强。通过基因工程手段生产出一种经过改造的T7噬菌体DNA聚合酶，它完全丧失了外切核酸酶的活性，其商品名为测序酶，是目前DNA序列测定中最常用的酶。

是一种耐热的DNA聚合酶，适用于PCR。最佳作用温度为75-80℃。于60℃时聚合酶活性仅剩50%，于37℃时聚合酶活性仅剩10%。在较低温度下开始缓慢聚合反应，可以避免引物从模板上解离。