1材料与方法
1.1试验材料
新鲜鸡蛋壳；胃蛋白酶，购于诺奥酶制剂生物有限公司；供试菌：植物乳杆菌、戊糖片球菌，由中国农业大学微生物实验室提供。
1.2供试试剂
柠檬酸钠溶液；NaOH溶液；HCl溶液；钙指示剂和钙标准溶液；EDTA标准溶液；硫酸、高氯酸、硝酸消化液；15%硫酸溶液。试剂均为分析纯，由北方天医化学试剂有限公司提供。
1.3试验方法
1.3.1蛋壳酶解钙溶液的制备。制备流程：新鲜蛋壳→粉碎→酶解→离心→冷冻干燥→灰化→测钙。其中粉碎、酶解、离心的具体步骤如下：①粉碎：鸡蛋壳在55 ℃烘干，用研钵粉碎，过800目筛3次；②酶解：选用胃蛋白酶，酶解时间分别为3、4、5 h，底物浓度分别为1∶2、1∶2.5、1∶3，添加量分别为1 800、2 000、2 200 U/g，酶解温度37 ℃，最适pH值3.0；③离心：酶解结束后，90 ℃灭酶10 min；待温度降至室温后，90 g离心10 min，取上清液装入灭菌的玻璃容器。
1.3.2发酵剂的制备。①菌种活化：将植物乳杆菌、戊糖片球菌、嗜热乳酸链球菌、丁二酮乳酸链球菌和嗜酸乳杆菌，按1%接种量分别接入经121 ℃、15 min灭菌的液体MRS培养基中，活化3代后菌数达到107～108 cfu/mL即可。②菌种传代：挑菌种于10 mL液体培养基，37 ℃培养24 h后，再吸取100 μL，放入10 mL液体培养基中，培养24 h后，再吸取100 μL，放入10 mL液体培养基中。③菌数测定：用倾注平板法测定活化3代后的菌种菌数。④菌种驯化：试验采用在液体MRS培养基中逐步增加酶解液含量，具体比例按表1进行，使乳酸菌逐渐适应以酶解液作为培养基的生长环境。
按表1比例混合后，将2个菌种分别接种于1号培养基，置37 ℃恒温摇床培养，每隔5 h观察1次培养状态。驯化过程中，每驯化1个梯度时，反复驯化2～3次。如果在9～10 h内，培养基出现明显浑浊，且菌落总数达到107～108 cfu/mL，则将其转接到下一比例的培养基中继续驯化。⑤高温灭菌：将蛋壳酶解溶液、培养基、枪头、离心管、玻璃瓶、玻璃棒在121 ℃灭菌15 min。
1.3.3钙含量测定――EDTA法。①样品处理：取2 mL的样品干法灰化后，加入1∶4盐酸5 mL，置于水浴上蒸干，再加入1∶4盐酸溶解并移入25 mL容量瓶中，用热无离子水多次洗涤灰化容器，洗涤水并入容量瓶，冷却后用无离子水定容。②测定方法：取5 mL经前处理后的样品，加水15 mL，加入0.05 mol/L柠檬酸钠2 mL、2 mol/L氢氧化钠2 mL、钙指示剂5滴，用EDTA溶液滴定至纯蓝色，记录EDTA消耗量。以蒸馏水代替样品做空白试验。再利用下式计算出钙含量。
总钙=■×100
式中：T―1 mL EDTA标准溶液相当于钙的毫克数；V―滴定样液消耗EDTA溶液体积；V0―滴定空白消耗EDTA溶液体积；V1―测定时取样体积；V2―蛋壳酶解样液定容的总体积；V3―称取蛋壳酶解样液体积。
1.4试验设计
1.4.1胃蛋白酶酶解蛋壳正交试验设计。根据试验因素水平选取3因素3水平编码表，选取L9正交表作为试验方案。
1.4.2蛋壳酶解液菌种发酵试验设计。发酵条件：将酶解液用植物乳杆菌和戊糖片球菌在37 ℃下进一步发酵，接菌量8.7%，发酵时间19 h，葡萄糖添加量3.93%。发酵液浓度为0.2 kg/L。发酵步骤：每隔6 h取30 mL发酵液，测定其钙含量和pH值，如果24 h内钙含量有下降趋势，用6 mol/L HCl调解pH值降至3，温度升高到37 ℃，终止发酵。
2结果与分析
2.1正交试验的直观分析
根据极差R的大小进行因素的主次排队，可以看出各因素的重要性：酶解时间＞底物浓度＞酶用量。且因素A、B、C的R值都大于空列的R值。因此，此次试验没有不重要因素的存在。
由图1可知，各因素最优的水平组合为：A2B3C2，与试验结果第5组最优矛盾，故还需进行验证试验。经验证试验测得A2B3C2钙含量为4 648 mg/100 g，小于试验所得值4 672 mg/100 g，故试验最优组合为第5组，即酶解时间为4h、加水量为12.5 mL、酶用量为0.055 g。因此，试验最佳酶解条件确定为pH值3，酶解温度37 ℃，酶解时间4 h，酶用量为0.055 g、加水量为12.5 mL。
2.2酶解发酵后样液中钙的含量
采用EDTA滴定法测定样液中钙的含量，具体步骤如下：分别取样品0.968 7、0.973 2、0.699 8 g，配制成酶解样液，均取5 mL于250 mL容量瓶中，而后定容待测。用EDTA滴定样液，分别消耗EDTA溶液体积25.13、24.70、24.93 mL，空白样消耗EDTA 0.28 mL。通过计算各组样液中钙含量分别为4 912、4 894、4 957 mg/100 g，平均为4 921 mg/100 g。可见，采用最优水平组合酶解，在此基础上经过发酵处理，每100 g蛋壳中获得4 921 mg钙。
3结论与讨论
试验利用酶解和发酵联用技术，研究了提高蛋壳中钙的生物利用率的最佳工艺条件，以提高蛋壳中钙的转化率。由试验可知，植物乳杆菌和戊糖片球菌1∶1混合后发酵胃蛋白酶酶解后的蛋壳酶解原液，发酵液中钙含量高于原酶解液，100 g蛋壳经酶解发酵可得4 921 mg钙，经过酶解方法处理只能得到4 672 mg钙，相比只用酶解的方法，酶解发酵方法对蛋壳钙转化率有影响，但影响不显著，而在实际生产中使用酶解方法比酶解发酵的方法简便、经济，故实际生产生活中应采用酶解的方法处理蛋壳，进行批量生产[6]。
