田 靓，朱仁义，沈 伟，袁证安，赵晓蔚1，李国栋2，
吴宏宇2，陆 敏2，黄晋江3，陆婉英1，黄青山4
(上海市疾病预防控制中心，上海 200336； 1 上海高科生物工程有限公司；
2 上海高科联合生物技术研发有限公司； 3 昆山博青生物科技有限公司；
4 复旦大学生命科学院遗传工程国家重点实验室）
关键词 生物酶；消毒剂；杀菌效果
消毒方法分为物理方法、化学方法及生物方法，用生物酶作为消毒剂应属于生物消毒法之一。生物消毒是利用动物、植物、微生物和（或）其代谢产物消除或杀灭环境中致病微生物，从而达到控制疾病发生和传播的目的〔1〕，生物消毒剂是指具有体外杀菌作用的生物制品。根据生物消毒剂的性质及来源，目前主要分为：①植物源消毒剂〔2,3〕：高等植物中抗菌的有效成分主要为香精油，香精油是酯、醛、酮和萜烯的化合物，萜类、生物碱类、黄酮类、甾体类、有机酸、蛋白质等也具有抗菌作用。②抗菌肽：生物体经诱导产生的一种具有抗菌活性的小分子多肽，目前从生物体中分离获得的抗菌肽已超过1000种。随着多肽化学合成技术的日趋成熟，国际上已有多条人工合成抗菌肽进入临床研究〔4〕。③噬菌体：噬菌体可以专一感染某种细菌，钻入细菌细胞并复制自己〔5〕，同事产生裂解酶，高度专一、快速裂解细菌细胞壁，杀死细菌并释放出新生的病毒。④生物酶：生物酶广泛存在于高等动物、原生动物、昆虫、植物和各种微生物中，是一种高效、高度专一、具备生物酶性质的生物催化剂，在作用过程中一般本身不消耗。随着近代生命科学与生物技术的迅速发展，将不同的酶类消毒剂进行复配，组合成复合生物酶消毒剂，可克服酶类消毒剂消毒谱单一的缺点。酶类消毒剂因具有高效、安全和理论上可反复使用的优点越来越受到关注。本文就酶类物质作为消毒剂的研究和应用进展进行综述。
1 酶类消毒剂种类
1.1 几丁质酶
几丁质酶是由N–乙酰葡萄糖胺以β–1，4键连接而成的线性多糖，是大部分细菌细胞壁的结构物质。染病植株产生的几丁质酶可破坏细菌细胞壁的几丁质〔6〕。目前国内外对于几丁质酶的研究主要为其抗菌机理，尚无相关应用研究。
1.2 过氧化物酶
已知对病原微生物有较好杀菌效果的过氧化物酶有卤素过氧化物酶、乳过氧化物酶（LPO）和葡萄糖氧化物酶等。Hansen等报道了使用弯孢菌卤素过氧化物酶可快速杀灭细菌、酵母和丝状真菌〔7〕，H2O2的使用量为单独使用时的1%左右，大大降低了H2O2的副作用，Johansen等〔8〕模拟医疗器械表面，制作菌膜生物模型，葡萄糖氧化酶和乳酸过氧化酶可杀死生物膜上的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、转糖链球菌等，同时复合物明显杀菌活性但可去除表面均膜的多糖水解酶，显示出既可杀菌又可去除生物膜的效果。目前，国内外对于过氧化物酶的研究仍处于实验时阶段，尚无产品应用。
1.3 核酶
核酶（Ribozymes,RNA enzymes）是具有酶活性的一段RNA，具有高特异性和无毒性的特点，是近年来抗病毒研究热点之一。核酶抗病毒作用目前多处于实验研究阶段，Sarver等将核酶英勇到抗HIV感染的研究中〔9〕，Weizsaker等研究串联核酶体外抗乙肝病毒的效果〔10〕，核酶抗病毒的治疗已显露希望的曙光，但国内外尚无将核酶作为消毒剂应用的研究。
1.4 噬菌体裂解酶
噬菌体裂解酶（bacteriphage lysins）是由噬菌体编码的在基因组复制晚期合成的一类蛋白质，它能够水解细菌细胞壁的肽聚糖从而杀灭细菌。研究表明噬菌体裂解酶对肺炎链球菌、炭疽杆菌、乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌都有很好的杀菌作用〔11-17〕。噬菌体裂解酶还处于实验室研究和临床实验阶段。美国的洛克菲勒大学的Nelson等〔18〕是全球对噬菌体裂解酶研究最深入的一个小组。他们利用直接提取和基因克隆表达等方法分离纯化出各类噬菌体裂解酶，并将切用于疾病的预防和治疗。Fischetti〔19〕利用牙膏、漱口液、吸入剂、鼻喷雾。气溶胶、眼药水、含片、粉末、糖果、糖浆、口香糖、粉末、锭剂、栓剂、片剂、局部霜剂、绷带、棉塞等作为载体，处理上呼吸道感染、皮肤感染、创伤、烧伤、阴道感染、眼感染、肠道疾病盒牙齿问题，并且还将噬菌体裂解酶制成针剂进行肌肉、皮下或静脉注射。国内对噬菌体裂解酶还处于实验室研究阶段，未见有应用方面的报道。
1.5 溶菌酶
溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N–乙酰胞壁质聚糖水解酶（N–acetylmuramidegycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。广泛存在于人体多种组织、鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、乳汁等体液中，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18中129个氨基酸残基构成，分子量为14000～15000dt的单一肽链。富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。抗菌谱较广，不仅可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌，对部分革兰阴性菌也有抑制效果。
溶解酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N–乙酰细胞壁酸（NAM）的1位碳原子间的β-1,4糖苷键。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分，对于革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁中肽聚糖含量不同，革兰阳性菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而革兰阴性菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶破坏革兰阳性菌细胞壁较革兰阴性菌强。
溶菌酶有较强的抗热性，最适pH6.5，酸性介质中可稳定存在；碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂（SDS、醇类、碳链不少于12的脂肪酸）对其有抑制作用；不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复。
1.6 细菌素和细菌自溶素
细菌素和细菌自溶素是细菌自身分泌的蛋白酶类物质，用于拮抗同种或异种细菌，或者参与细菌自身重要的生理活动，如细菌繁殖，细胞分裂，孢子形成等〔20〕 。溶葡萄球军最初由Schindler和Schu-hardt〔21〕从Staphylococcus simulans biovar staphylolyti-cus的培养物中发现，是目前国内外研究较为成熟的细菌素。该酶基因重组后在大肠杆菌或枯草杆菌中得到克隆表达〔22〕。基因重组溶葡萄菌酶为单链分子，分子量约为27KD，由近250个氨基酸组成，等电点pH10.5～11.0，基因的核酸组成有近1500个核苷酸。
溶葡萄球菌酶可裂解葡萄球菌细胞壁肽聚糖中的Gly-Gly键〔23〕，使细胞壁溶解而致微生物死亡。溶葡萄球菌酶只是针对细胞壁具有这种结构的细菌，所以只能裂解革兰阳性细菌细胞壁，使其死亡。
溶葡萄球菌酶最适温度37℃，超过55℃酶活力迅速下降；酶作用的最适pH为8～10，碱性环境中杀菌作用较强，酸性环境中杀菌作用减弱；EDTA、DDT、PMSF、PCMB对其无显著影响，Ba2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+能不同程度地抑制溶葡萄球菌酶活性，而Zn2+则能有小的活性效应，可能和该酶是含锌蛋白有关，除SDS能使酶失效外，Tween80、甘油、乙醇等其他表面活 性剂（增溶剂）均有利于酶的作用。
1.7 复合溶葡萄菌酶
溶葡萄菌酶和溶菌酶裂解病原微生物均是针对细胞壁肽聚糖，但作用位点有所不同（图1）。为拓宽酶类消毒剂的杀菌谱、提高酶类消毒剂的抗菌能力，可将其进行复配，制成以溶葡萄球菌酶和溶菌酶为主要成分的复合溶菌酶消毒剂〔24〕。Cisani等〔25〕研究发现复配后的溶葡萄球菌酶与溶菌酶具有协同杀菌作用，复配后的酶对不同病原菌的抑菌效果提高了16到200倍。
国内90年代初开始有复合溶菌酶消毒剂研究，复合溶菌酶在实验和应用研究中都取得重要突破，复合溶菌酶产品已经应用于临床消毒与治疗〔2〕。
2 酶类消毒剂的应用
国内外酶类消毒剂的应用研究主要集中在以溶葡萄球菌酶和溶菌酶为主要成分的复合溶菌酶在消毒领域的应用。复合溶菌酶消毒剂由于无毒性，无刺激性以及不易产生耐药性的独特杀菌机理，广泛应用于外科、烧伤创伤科、妇产科、口腔科、皮肤科和耳鼻喉科等的冲洗、消毒和治疗，其在临床使用的复合溶葡萄球菌酶消毒制剂可配制成水剂、喷雾剂、膏剂、漱口剂、滴耳剂、洗消剂等。
2.1 皮肤消毒
复合溶菌酶消毒剂无刺激、可反复使用，对医院内的交叉感染、烧伤和手术病人细菌感染，尤其是耐药性金黄色葡萄球菌的感染有很好效果，可用于手术前医护人员或病人手术前局部及全身皮肤的消毒〔28〕。罗引珍等〔29〕报道应用于复合溶菌酶消毒剂对幼儿手去污染效果好于肥皂流水洗手，并具有一定持续效果。
2.2 粘膜消毒
体外杀菌实验证明，复合溶菌酶能有效抑制和杀掉口咽部致病菌。长征医院对45例急慢性咽炎、扁桃体炎患者用溶葡萄球菌酶复方制剂治疗显示，有效率达到90.0%，在治疗7天后咽部细菌培养阴性〔30〕。李瑛等〔31〕用直接涂片法观察152例经溶菌酶治疗的口腔炎性疾患病例用药前后口腔菌群的变化。经细菌学检测，复合溶葡萄球菌酶对口腔中的革兰阳性细菌和某些阴性细菌有明显的抑杀作用，用药后口腔细菌的数量和细菌阳性率均有明显下降。
马先军等〔32〕研究了局部病灶喷涂复合溶葡萄球菌酶口腔喷剂，发现可达到杀灭病原菌的目的，对治疗轻中度冠周炎患者，为较好的一种新方法。韩剑星等〔33〕发现复合溶葡萄球菌酶用于治疗小儿口腔白色念球菌病，疗程短，治愈率高。孙颖丽等〔34〕研究了新型口腔清洁剂对呼吸相关肺炎及口腔溃疡的作用，结果显示在传统口腔护理基础上给予新境界喷雾剂能有效地减少病人口腔溃疡和呼吸机相关肺炎（VAP）的发生。同时，复旦大学体外抗流感病毒研究中显示：复合溶溶葡萄球菌酶制剂具有杀灭流感病毒的作用，其效果和磷酸奥司他韦没有差别，在预防流感流行中具有一定的应用前景〔35〕。还有学者进行局部使用溶葡萄球菌酶治疗持久性鼻腔葡萄球菌携带的有效性和安全性研究〔36〕，结果显示治疗5d可以显著降低葡萄球菌的携带率，并且没有检测到副作用。经对溶葡萄球菌乳膏根除棉鼠模型金黄色葡萄球菌鼻定植的效果研究显示〔37〕，单次给药量150μg溶葡萄球菌酶和矿脂乳膏，100%试验动物金黄色葡萄球菌鼻定植显著减少，棉鼠模型金黄色葡萄球菌鼻定植清除率93%。单剂量溶葡萄球菌酶乳膏比单剂量莫匹罗星软膏和Nisin更有效地根除金黄色葡萄球菌鼻定植。Cui等〔38〕研究了载溶葡萄球菌酶壳聚糖-水包油乳膏制备方法及其对金黄色葡萄球菌的抑制效果。结果表明，溶葡萄球菌酶的浓度与其从乳膏中释放行为有直接关系。2mg/g和3.5mg/g时溶葡萄球菌酶快速的从乳膏中释放出来，而溶葡萄球菌酶的浓度载5mg/g时表现出稳定释放的状态。同时相比于石墨微粒的空白对照组，具有缓释溶葡萄球菌酶效果的CCL乳膏对金黄色葡萄球菌的抑制效果比传统的治疗效果好。
2.3 创面消毒
复合溶葡萄球菌酶消毒制剂适用于所有创面感染的预防和治疗，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染效果明显。包括烧伤，烫伤，刀伤，骨创伤，褥疮、窦道、糖尿病足等经久不愈的感染创面，疖、痈、脓疱疮、甲沟炎、脓肿、乳腺炎等皮肤和皮下组织感染；肛瘘、肛周脓肿、手术等切口感染，静脉插管及长期接受导管治疗的局部感染等的预防与控制。
首都医科大学附属朝阳医院〔39〕对肛瘘患者使用复合溶葡萄球菌酶杀菌纱布进行治疗，结果显示其应用于肛瘘术后创面，对创面细菌具有较强的杀灭作用，细菌清除率高；可明显降低创缘炎性反应，减少创面渗出，并可加速创面愈合；临床应用安全，对创面无刺激。郇京宁等〔27〕在对烧伤患者创面的细菌感染治疗研究中发现，溶葡萄球菌酶制剂能有效控制烧伤创面MRSA感染。
2.4 其他方面
复合溶菌酶消毒剂在1μg/ml的浓度下不仅能够杀灭塑料和玻璃表面生物膜上葡萄球菌也能彻底破坏葡萄球菌生物膜基质〔7〕。复合溶菌酶消毒剂还可配制成喷雾剂、膏剂,漱口剂、滴耳剂、洗消剂、妇女洗液、鼻部喷剂、足部消毒剂等，并且可代替一些有害的化学防腐剂应用于水产、香肠、奶油、生面条等食品保藏。
3 溶葡萄球菌酶的检测方法
溶葡萄球菌酶是以溶葡萄球菌酶和溶菌酶为主要成分的，其中以溶菌酶的检测方法已有国家标准要求〔40〕，采用比浊法检测，本文只针对溶葡萄球菌酶的检测方法进行综述。
目前国内外还没有统一的标准用于检测溶葡萄球菌酶酶活性，文献报道的溶葡萄球菌酶酶活性测定方法主要有比浊法，比色法和6甘氨酸底物法。
3.1 比浊法
这是最常用的一种方法，检测时可将金黄色葡萄球菌的新鲜培养物悬于0.05mol/L Tris-HCL、0.145mol/L NaCl的缓冲液（pH7.5）中，溶葡萄球菌酶作用过程中定量的降低菌液的浊度，浊度下降值与酶量成正比，通过吸光度下降值的测定可计算出样品的酶活性。Sigma和Ambi公司常采用此方法进行溶葡萄球菌酶活性的测定。
3.2 比色法
Zhou等〔41〕报道了利用比色法进行溶葡萄球菌酶活性测定。以偶联活性艳蓝染料KNR的金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖（KNR-PG）为色源底物，根据酶作用过程中定量的释放的带有KNR染料基因的小分子可溶性片段产物，再除去未反应的不溶性底物后，对上清液进行比色测定，计算酶活性。此法简便易行，灵敏直观。
3.3 甘氨酸底物测定法
Kline等〔42〕报道了利用6-甘氨酸底物定量检测溶葡萄球菌酶活性的方法。通过将6-甘氨酸肽进行乙酰化，作为测定用底物，在检测时，被酶水解的底物肽的N端基团游离出来，与加入的TNBS反应形成显色基团，经过一定时间的发色反应，通过显色基团的光密度值回算出酶活性。此方法专一性高，但底物的合成及后期制备都比较复杂，周期也较长，且相比于比浊和比色方法，费用也较高。
3.4 3种检测方法的比较
3.4.1 线性范围和检测线 比浊法线性范围相对较窄，当反应体系中酶终浓度在0.1～0.25U /ml较窄的范围内具有较好的线性，相关系数在99%左右，而6-甘氨酸法中酶浓度在1.25～20μg/ml范围内都具有较好的相关性，相关系数可达99%，比色法反应体系中酶的终浓度范围可在0.2～1.0U /ml，相关系数可达99%，明显优于比浊法，同时，检测下限又明显优于6-甘氨酸法。
3.4.2 反应时间 比浊法的反应时间为10min，是3种方法中最短的。6-甘氨酸法所需的反应时间最少60min，加之显色时间需20min，整个检测时间相对较长，而比色法的反应时间为20min,之后的离心时间约10min，整个检测时间相对较短。
3.4.3 检测用底物及其制备方法 在比浊法检测中使用的底物为金黄色葡萄球菌菌体细胞，虽然制备简单，但使用周期短，不易保存，稳定性较差，且存在一定的生物安全隐患，6-甘氨酸法的的底物使用的是乙酰化的6-甘氨酸肽，所制备的母液需平衡8w，作为正式使用的底物则仍需要在使用前至少平衡4w，整个制备过程复杂且漫长，而比色法的底物则采用金黄色葡萄球菌死菌体进行一系列简单处理后，得到肽聚糖组分，再用活性染料进行染色，整个制备周期为一星期，并可进行大批量的制备，制备好的底物可以于4℃长期保存放置，使用周期长，稳定性好，安全性高。
3.4.4 重复性 由于比浊法中菌体生长不易控制，及底物菌体的活力偏差较大，直接影响测定的结果，在检测时需尽可能保持每次测定时所用菌体活力的一致，且菌体浊度只有在0.25～0.3时才具有较好的重复性，而6-甘氨酸法则需要在较低的底物浓度下进行，为保证良好的重复性，必须严格控制好底物浓度，在比色法中底物是过量的，相对于比浊法，由于是死菌体制备的，不存在明显的偏差，使检测过程更容易控制，重复性更好。
综上所述，色源底物比色法从底物制备的方法简易程度、酶活性检测时间的长短、检测数据的重复性及精密性，均显示其作为溶菌葡萄球菌酶的活性检测方法具有明显优势。
参考文献
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〔2〕 王立国，马祁.天然产物对植物病毒的抑制作用[J].中国生物防治，2000.3(2):127.
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〔4〕 以下略去
