一、实验原理
利用化学诱变剂诱发突变是遗传学研究和育种工作的常用手段。
化学诱变剂按其诱变机理一般可分为三类：（1）通过掺入DNA分子引起突变，（2）通过和DNA直接起化学反应后引起突变，（3）通过一对核苷酸的插入或缺失引起突变。本实验以烷化剂亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）为诱变源，它的诱变机理属于第二类。现在一般认为烷化剂的诱变机理主要是由于对鸟嘌呤N-7位置上的烷化作用（鸟嘌呤其它位置以及其它碱基的许多位置也可能被烷化），然后被烷化的碱基同碱基结构类似物作用机制一样，通过DNA复制，引起碱基错误配对导致碱基转换或颠换造成基因突变。通常烷化后的碱基（G）偶然与胸腺嘧啶（T）错误配对代替胞嘧啶（C）。
NTG主要诱发GC—AT的转换。它除有较强的诱变作用外，还能诱发邻近位置基因的并发突变，而且特别容易诱发DNA复制叉附近的基因突变，随着复制叉的移动，它的作用位置也随着移动。
NTG是一种超诱变剂，它的诱发效率可使百分之几十的细菌发生营养缺陷型突变，因此经NTG处理的细菌不必经过青霉素浓缩处理，而只要通过适当的筛选方法就能检出营养缺陷型。一般讲，一种高效率的诱变剂，只要有一种有效的筛选方法是可以获得任何突变型的。
诱变处理所用的细胞一般为对数期细胞。化学诱变剂的剂量一般以药物浓度表示。一定的剂量有一定的杀菌率和诱变率，通过杀菌率和诱变率可帮助我们了解一定剂量的诱变作用。诱变作用往往与药物处理时间和温度有关。具有较强诱变作用，较弱杀菌作用的诱变剂（如烷化剂）可采用较低剂量（约50％的杀菌率），反之，紫外线一般采用较高杀菌作用的剂量（如90％—99.9％杀菌率）。
二、实验材料
1.啤酒酵母菌单倍体26－4（来自上海酵母厂）。
2.啤酒酵母菌单倍体143—2（来自上海酵母厂）。
三、实验器具和药品
1.用具：培养皿（9厘米），三角瓶（150毫升），试管，离心管，吸管（1毫升、5毫升），玻璃涂棒，玻璃珠，丝绒布，圆木柱。
2.培养基
（1）基本培养基：葡萄糖10克，CaCl2·2H2O0.1克，KH2PO40.876克，（NH4）2SO41克，K2HPO40.125克，MgSO4·7H2O0.5克，NaClO.1克，KI母液1毫升，微量元素母液1毫升，维生素母液1毫升，蒸馏水加到1000毫升。高压灭菌8磅25分钟。
注：①碘化钾母液：1克/毫升。
②微量元素母液：H3BO3（硼酸）1毫克/100毫升、ZnSO4·7H2O（硫酸锌）7毫克/100毫升、CuSO4·5H2O（疏酸铜）1毫克/100毫升、CoCl2·6H2O（氯化钴）5毫克/100毫升。
③维生素母液：维生素B140毫克/100毫升、烟碱酸40毫克/100毫升、肌醇200毫克/100毫升、核黄素20毫克/100毫升、对-氨基甲酸20毫克/100毫升、吡哆醇40毫克/100毫升、泛酸20毫克/100毫升、生物素3毫克/100毫升。以上三种母液都需高压灭菌15磅15分钟。
（2）基本固体培养基：在上述培养基加2％琼脂即可。
（3）完全液体培养基：蛋白胨20克、酵母浸出汁10克、葡萄糖20克、蒸馏水1000毫升，pH6.0，高压灭菌8磅25分钟。
（4）完全固体培养基：在上述培养基加2％琼脂即可。
（5）无菌水
（6）生理盐水（0.85％）
（7）0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：0.2mol/LNa2HPO412.3毫升、0.2mol/LNaH2PO487.7毫升。
3.诱变剂：亚硝基胍（NTG）。
四、实验说明
1.本实验采用的诱变剂是一种超诱变剂，因此安全操作十分重要。称量时，最好在某一固定地方，戴好橡皮手套和口罩在密闭箱里进行，以防止NTG颗粒吹散。操作时，不能用嘴直接吸取含有NTG的液体，应改用洗耳球吸取。凡含有NTG的器皿和用具都要用浓碱处理。
2.利用酵母菌进行诱变工作，首先要获得单倍体菌株。在二倍体细胞中，隐性性状（突变往往是隐性）不能表现。而单倍体细胞，隐性突变性状就能直接表现。因此，获得单倍体细胞对诱变工作来说是重要的。
一个简单的办法是：利用营养细胞和子囊孢子的耐热性差异进行热处理，就能很容易得到单倍体细胞。具体做法是把二倍体营养细胞接种于产孢子培养基的斜面上，用5毫升无菌水制成悬浊液，将此悬浊液浸于55℃—60℃恒温水浴中，不断振荡处理约10分钟（处理时间，根据对营养细胞耐热性预备试验而定。一般以约106—107的营养细胞菌悬液经一定时间处理后，用接种环挑取一环菌液接种于完全平板或斜面，30℃培养2天后，看完全不生长或只有一两个菌落生长为标准作为所需的处理时间）。处理后，用自来水迅速冷却，适当稀释涂布于完全培养基平板，30℃培养2天后，用接种环挑取较小的圆锥形菌落镜检，从形态上判断单倍体细胞。用这方法，一般要划线纯化后较为可靠。为了进一步提高可靠性，可接种于产孢子培养基上看是否产孢子来确定。如先用一定浓度的纤维素酶处理，再进行热处理可提高获得单倍体细胞的效率。
五、实验步骤
1.制备菌悬液
（1）将酵母菌单倍体菌株#26—4（或143—2）从保存斜面上，用接种环挑一些菌，接种到盛有5毫升完全液体培养液的灭菌离心管中，28℃—30℃培养16—18小时，共接2支。
（2）将培养过的菌液倒入盛有玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡10分钟，使酵母菌充分均匀分散。
（3）将上述菌液各吸4毫升于2支灭菌离心管中离心（3500转/分，10分钟），倒去上清液，打匀菌块，各加4ml无菌水制成菌悬液，并存放在30℃水浴中备用。
2.活菌计算（用没有经NTG处理的菌液作对照）
（l）从30℃水浴中取出一支菌悬液（4毫升），加生理盐水1毫升，然后再用生理盐水稀释到10-4、10-5。
（2）从10-4或10-5稀释液中吸取0.1和0.5毫升于灭菌培养皿中，各做二皿，共四皿。
（3）将熔化不烫手的完全固体培养基倒入上述含菌的培养皿中（每皿约倒入培养基15—20毫升），摇匀、放平待凝，30℃培养二天，计算活菌数。
3.诱变处理
（1）称取NTG1.5毫克于灭菌的离心管中，然后加入1毫升pH6.00.2mol/L磷酸缓冲液，使其完全溶解，并存放在30℃水浴中备用。
（2）从30℃水浴中取出另一支菌悬液（4毫升），倒入上述含有NTG的离心管中（此时NTG最终浓度为300γ/毫升），充分混匀，立刻放入30℃水浴中，同时计算时间，30分钟后取出，立即离心（3500转/分），将上述废液倒入浓NaOH溶液中，打匀菌块，加5毫升生理盐水，再离心（3500转/分）一次，倒去废液，加5毫升无菌水制成菌悬液。
（3）将熔化不烫手的完全培养基倒入灭菌培养皿中（每皿15—20毫升），放平待凝，共20皿。
（4）将经NTG处理过的菌液稀释为10-3（希望每只培养皿中长50—100个菌落），吸取0.1毫升和0.05毫升于上述预先倒好的培养皿中，各倒10个皿。
（5）用灭过菌的Y形玻璃涂棒将菌液涂匀，30℃培养3—4天，计算活菌数。
（6）计算杀菌率及存活率（从诱变组中选择不污染、菌落分布均匀、菌数适中的培养皿留作下步影印备用）。
4.影印
（1）准备好影印用丝绒布（高压灭菌，干燥箱内烘干备用）。
（2）将一定数量的母平板和预先准备好的基本培养基及完全培养基平板，以一个母平板，一个基本平板，一个完全平板作为一组，每组编号，并在每个平板的底部用玻璃铅笔划上箭头作为标记。
（3）将灭菌的丝绒布放在圆本柱上，用橡皮筋扣住（注意绒面不能用手摸），先取母平板倒复在绒面上，然后用铅笔轻轻在皿底上均匀地敲几下，取下母平板（放冰箱保存起来），立即把MM平板（基本培养基平板）按箭头标记的相同方向复印上去（方法同上），取下MM平板，再把CM平板（完全培养基平板）也按上述同样方法复印，印毕，30℃培养2—3天。影印见图14－l。
5.点种复证
（1）将每组复印的平板按箭头标记的同一方向进行比较，找出CM平板上生长而MM平板上不生长的相应菌落，用玻璃铅笔在相应位置的母平板上作上记号，并编号，以便进一步复证。
（2）准备MM平板和CM平板，平板数量可根据编号菌落多少而定，一个皿可划36个格子左右。
（3）用灭菌牙签从母平板上挑取已编号的单菌落，按顺序在MM和CM平板上的相应位置上点种，点毕，30℃培养2—3天左右。
（4）从温箱中取出培养皿，用接种环挑取确实只能在CM上生长而MM上不生长的单菌落接种于CM斜面，30℃培养2天
后放冰箱保存，供生长谱鉴定用。
6.生长谱鉴定方法与微生物大肠杆菌诱变营养缺陷型的鉴定方法相同，所以从略。
六、实验结果
杀菌率： 
诱变率： 
