（ 云南农业大学动物科学技术学院，云南省动物营养与饲料科学重点实验室，昆明650201）
摘要：葡萄糖氧化酶是一种绿色、安全、无毒副作用的饲料添加剂，能够显著改善动物肠道微生态平衡以及肠道消化环境、保护肠道健康、提高饲料利用率、促进动物生长、增强动物体抗病能力。微生物霉菌具有来源广泛、生长周期短等优点，被广泛用作工业生产葡萄糖氧化酶的来源。文章对葡萄糖氧化酶的生产及其在饲料工业中的应用研究进行了简述。
关键词：葡萄糖氧化酶；微生物；生产；饲料工业
中图分类号：Q554；S816.8 文献标志码：A 文章编号：1001-0084（2015）10-0001-07
Production of Glucose Oxidase and Its
Application in Feed Industry
FANG Juncheng, YOU Ruiqi, SONG Cong, GUO Rongfu*
（ College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Yunnan Province Key Laboratory of
Animal Nutrition and Feed Science, Kunming 650201, China）
Abstract: Glucose oxidase is a kind of green, safe, non-toxic side effects of feed additives. It can significantly improve the intestinal microecological balance and animal intestinal digestion environment, protect the intestinal health, improve the utilization rate of feed and promote animal growth and enhancing animal body resistance. Microbial mold has the advantages of sources and short growth cycle, which is widely used in industrial production of glucose oxidase. In this paper, the production of glucose oxidase and application in feed industry were reviewed.
Key words: glucose oxidase; microbes; production; feed industry
葡萄糖氧化酶（GOD）是一种需氧脱氢酶，属氧化还原酶，能够在有氧环境下，专一氧化β-D-葡萄糖为D-葡萄糖酸-δ-内酯和过氧化氢，D-葡萄糖-δ-内酯又以非酶促反应方式自发水解为葡萄糖酸。早期GOD命名为β-D-吡喃葡萄糖氧化酶或β-D-吡喃葡萄糖需氧脱氢酶，后来简称为葡萄糖
氧化酶，1961年国际生化协会酶委员会将其系统命名为β-D-葡萄糖，分子式为C6H12O6，欧盟系统编号为EC 1.1.3.4[ 1 ]。
在1904年，人们就发现了GOD，但当时没有引起足够的重视[ 2 ]。直到1928年，Muller首先从黑曲霉菌丝体经压汁处理后的无细胞提取液中发现了GOD，进行了葡萄糖酸形成的酶学研究，并进一步研究了其作用机理。此后Nakamatsu、Fiedurek、Rogalski等先后对GOD做了大量研究工作并投入生产。后来各国学者又相继在拟青霉属、胶霉属及帚霉属等中也提纯出了GOD。20世纪40年代就开始有GOD产品出售。50年代日本获得了结晶GOD。60 年代日本长赖工业公司也开始有GOD 商品出售。70年代GOD在国外应用已经很广泛。我国于20世纪70年代开始系统的研究生产GOD，自1986年开始研究GOD的制备提纯工入生产。河北省微生物研究所在GOD的制备和应用方面作了许多深入地研究，取得了突破性的进
展，先后制备了诊断用的GOD、食品用GOD等多种剂型，目前已成为GOD专业化生产基地。1999年农业部将其定为12种允许使用的饲料酶制剂添
加剂之一。2013年12月30日农业部发布的《饲料添加剂品种目录（2013）》中，对我国允许使用的饲料级GOD生产菌株进行了专门的规定，限定为特异青霉和黑曲霉[ 3 ]。经过几十年的发展，目前GOD在食品和医药行业中已得到了广泛应用，但GOD作为饲料添加剂用于畜牧养殖业中的研究报道相对较少。
1 GOD的酶学性质
高纯度GOD为淡黄色粉末，易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、乙二醇和甲酰胺等有机溶剂，50%丙酮、66%甲醇都能使其沉淀，可以被弱酸性的离子交换树脂及氧化铝等吸附[ 4 ]。GOD 最大光吸收波长为377 和455 nm，在pH 为2.2~8.4，温度为20~70 ℃均可起催化作用，其适宜温度为30~60 ℃，最适pH为5.0~5.6。GOD具有很好的稳定性，不受乙二胺四乙酸、氰化钾及氟化钠抑制，但Ag+、Hg+、亚硫酸氢钠对其有强烈的抑制作用，而Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+对其具有不同程度的激活作用[ 5 ]。固体GOD酶制剂在0 ℃下保存，至少可稳定2年，在-15 ℃下可稳定8年。一般情况下，GOD反应受底物浓度的影响不大，葡萄糖底物浓度在5%~20%时，反应速率几乎保持不变[ 6 ]。
2 GOD的空间结构
GOD是由两个完全相同的糖蛋白经二硫键共价结合而形成的一个同型二聚体结构，每个糖蛋白单体又含有2个区域：一个与底物β-D-葡萄糖以4个α螺旋支撑一个反向平行的β 折叠形式结合；另一个与部分辅基FAD以非共价的β 折叠的形式紧密结合，GOD空间三维结构模拟图见图1。
3 GOD的催化反应特性
3.1 GOD在不同反应条件下的反应过程
GOD的催化反应按反应条件不同有以下3种形式[ 7 ]: （1）无过氧化氢酶存在时：（2）有过氧化氢酶存在时：（3）过氧化氢酶和乙醇同时存在时：
通常情况下，GOD是通过与过氧化氢酶组成一个氧化还原系统发挥作用的。GOD会在有氧环境下氧化β-D-葡萄糖，生成D-葡萄糖酸-δ-内酯，同时产生过氧化氢；过氧化氢酶能够将生成的过氧化氢分解成水和氧；水再与D-葡萄糖酸-δ-内酯结合产生葡萄糖酸[ 8 ]。葡萄糖氧化酶作用机理见
图2。
3.2 GOD的催化反应底物特异性
葡萄糖氧化酶具有高度的底物专一性，其对α-D-葡萄糖的催化活性不及β-D-葡萄糖的1%，且对L-葡萄糖完全没有活性[ 9-10]。GOD在不同底物
条件下的催化速率见附表。
4 GOD的生产
GOD 广泛地分布于动物、植物和微生物体内，但动植物体内含量甚微且不易提取，而微生物霉菌具有生长繁殖速度快、来源广泛等特点，使其成为生产GOD的主要来源。工业上一般采用黑曲霉和青霉菌属菌株作为GOD的生产菌株。另外米曲霉、土曲霉、拟青霉属、胶霉属、帚霉属、镰刀霉菌及柠檬酸霉属等也能生产GOD。
4.1 GOD生产菌株
天然菌株产GOD水平较低，难以直接用来生产GOD，工业上通常通过诱变处理及基因工程技术等来筛选、培育高产菌株。诱变育种包括物理诱 变、化学诱变以及多种不同诱变方法的复合诱变等。朱运平等采用紫外诱变、亚硝酸钠化学诱变以及紫外-亚硝酸钠复合诱变3种方法对1株产胞外GOD黑曲霉菌株1504进行诱变育种，最终选育出1株产酶活力达到186.32 U·mL-1，为原始菌株酶活力3.8倍的菌株[11]。基因工程育种是一种体外重组DNA技术，即在分子水平上对目的DNA片段进行分子改造或将目的GOD基因连接到特定载体上表达。该方法是一种旨在定向改变菌株遗传性状或创造一种新型菌株的育种技术。基因工程技术培育出来的基因工程菌株能够减少杂蛋白质的分离，后续简化GOD的分离、纯化程序具有重大意义。Crognale等将一株青霉的GOD 基因成功导入毕赤酵母中表达，发酵培养酶活可达到50 U·mL-1[12]。刘虎军等将GOD目的基因和表达载体pPIC9K连接经电转化导入毕赤酵母GS115宿主菌中表达，获得了一株产GOD酶活为25 U·mL-1的菌株[13]。
4.2 GOD生产的发酵工艺
培养基组成、发酵条件的控制及发酵工艺设备等都是直接影响发酵效果的主要因素。碳源和氮源是培养基中对菌种发酵的两个最基本影响因
素。不同的菌种对碳源有特异的选择性[14]。一般工业生产中选用葡萄糖作为GOD菌株的碳源，葡萄糖是GOD最主要的诱导物。也有一些霉菌在以蔗糖、麦芽糖、木醇糖、果糖等作为碳源时，其反应也很活跃，Semashko等研究了3个青霉菌的突变菌株funiculosum BIMF-15.3、MM95.132和46.1均能在分别以葡萄糖、木醇糖、果糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘油和甘露醇作为碳源的培养基上生长并产生GOD，且在以葡萄糖、蔗糖、果糖为碳源的培养基中GOD 的产量较高， P. funiculosumBIMF-15.3在以木醇糖或甘露醇为碳源时产酶反应活跃，而P. funiculosum 46.1在麦芽糖为碳源时产酶反应活跃[15]。碳源的初始浓度也会影响霉菌GOD的合成。初始碳源浓度约为8%时适宜GOD合成，浓度过低或过高都会降低产酶水平，初始碳源浓度降低，会影响菌体生长；浓度增大，会因代谢产物大量生成而形成阻遏作用[16]。相对于碳源，菌种对氮源的选择特异性没有那么严格。氮源分为有机氮源和无机氮源，有机氮源包括蛋白胨、玉米浆以及麦芽浸粉等；无机氮源主要为硝酸盐和铵盐。研究表明，将无机氮源与有机氮源联合使用比使用单一氮源效果要好[17]。发酵过程是一个复杂的反应系统，影响因素包括培养基初始pH、接种菌龄与接种量、温度控
制、发酵时间、摇瓶转速与溶氧量及钙离子添加量等。GOD在pH为5~6时具有较好的稳定性，且活力较高，尤其是在pH约为5.5时，酶活达到最
高，pH<4.5或>6.5时，酶活均呈下降趋势[16]。适宜接种菌龄一般选择在对数生长期的后期，即培养液中霉菌量接近高峰的时间段内，过早或过迟接种都对菌种的发酵不利。菌种接种量在菌液黏度及溶氧量等条件允许情况下，接种量越大越有利于提高发酵效率，但过大会影响产物的生成。黑曲霉的最适发酵温度为30~31 ℃，青霉最适发酵温度较低，为26~29 ℃，且前期霉菌生长所需温度略高，后期GOD合成所需温度略低。研究表明，将黑曲霉菌种在25~37 ℃进行产酶培养，培养温度为30~35 ℃， 尤其在30 ℃为最好， 经多次试验发现，如果在培养开始15~20 h将温度固定在30~35 ℃，之后降至30~31 ℃，产GOD量最高，产酶量将增加3~4倍。不同菌种达到最大产酶量的发酵时间各不相同。霉菌是需氧菌，在菌株生长及产酶过程中都需要足够的溶解氧，但溶解氧也不是越多越好，研究表明，培养基中稍低浓度的溶解氧可以促使高活性的GOD 生成，若溶解氧过高，胞内GOD 的生成速率虽高，但可利用的葡萄糖很快被氧化为葡萄糖酸，几乎无剩余的葡萄糖和足够的时间获得较高活性的酶。酶产量与摇瓶转速与空气流量、溶解氧以及菌体耐受程度等因素有关。适宜低浓度的钙离子对GOD的合成有促进作用[8]。一般在培养基中添加一定量的CaCO3，不溶性的CaCO3不仅可以提供低浓度的钙离子，还可作为菌株的生长载体。研究表明，控制培养基中CaCO3浓度在约35 g·L-1时，对霉菌发酵产GOD的促进作用最为明显。发酵工艺设备的设计是否合理也直接影响到发酵效率的高低。在GOD发酵过程中引进一个带有膜过滤器的外循环系统，结果膜过滤发酵GOD产生速率比分批发酵提高约3倍，且能在较长时间内维持较高的产酶率。
4.3 GOD
霉菌发酵除了产生GOD，还会产生很多其他无用的杂蛋白质，主要是过氧化氢酶、α-淀粉酶、蔗糖酶和其他蛋白质。为了得到活性和纯度较
高的GOD，必须对粗GOD产物进行分离、纯化。目前，用于GOD提纯的方法有层析法、沉淀法、吸附法、结晶法、亲和色谱及反向胶束法（RM）等。层析法目前应用得比较多，一般包括粗GOD液的浓缩、盐析、酶的脱盐、层析等步骤，即先将粗GOD液进行浓缩，一般通过离心、超滤等步骤来完成，经过浓缩后的粗酶液通过硫酸铵沉淀，将目的蛋白沉淀，同时也能有效除去杂蛋白，盐析后目的GOD蛋白再经过凝胶柱脱盐，将酶蛋白和盐基有效的分开，脱盐后的酶液再通过层析等手段进一步纯化。目前应用广泛的层析有分子筛层析和纤维素离子交换层析。苏茉等将由黑曲霉H1-9b菌丝体获得的GOD粗酶液经DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200 凝胶过滤层析， 得到的GOD 纯品比活力为30 569.7 U·mg-1， 回收率为30.2%，提纯倍数为粗酶的41.4倍[18]。沉淀法通过选择合适的沉淀剂一步沉淀或分级沉淀将GOD与其他杂蛋白质分离，沉淀剂一般有乙醇、丙酮、硫酸铵、单宁酸等。吸附法是在一定条件下，吸附材料的活性基团与GOD通过疏水基因相互作用而被吸附，而后通过改变缓冲液的浓度和pH，使其与吸附剂解吸附，从而得到纯度较高的GOD。
葡萄糖氧化酶的生产及其在饲料工业中的应用(下)
