选取NAD+补救途径中烟酸磷酸核糖转移酶(NAPRTase)、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(NAMNAT)和NAD+合成酶(NAD+ synthetase)的编码基因，克隆构建获得重组质粒pET-21a-pncB、pET-21a-nadD和pET-21a-nadE，经限制性内切酶Bam H I和Xho I酶切鉴定，其条带大小分别为1203、642和828 bp (图 3-A)，经测序后比对匹配一致，pET-21a-pncB、pET-21a-nadD和pET-21a-nadE构建成功。
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| 图 3 重组质粒双酶切鉴定及SDS-PAGE分析图Figure 3 SDS-PAGE analysis and identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion. A: identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion. Lane 1: pET-21a-pncB; lane 2: pET-21a-nadD; lane 3: pET-21a-nadE; M: DL10000 DNA marker. B: SDS-PAGE analysis of recombinant strains for over-expressed enzyme. Lane 1: pET-21a-pncB; lane 2: pET-21a-nadD; lane 3: pET-21a-nadE; lane 4: pET-21a; M: protein molecular marker. |
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图选项
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对E. coli BL21/pET-21a和构建的重组菌株进行粗酶液的SDS-PAGE分析验证(图 3-B)。与空白组4号泳道对比，重组菌E. coli BL21/pET-21a-pncB、BL21/pET-21a -nadD和BL21/pET-21a-nadE分别在约45、25和35 kDa处有一条明显特征条带，表明基因pncB、nadD和nadE编码的NAPRTase、NAMNAT和NAD+ synthetase在大肠杆菌中成功表达。
分别测定重组菌株的生长情况和胞内辅酶NAD+含量(表 2)，在细胞量上，重组菌株的生物量较原始菌株提高20%；在NAD+含量上，重组菌株中合成NAD+关键酶基因pncB、nadD和nadE得到了过量表达，胞内NAD+的浓度分别提高了252.4%、101.7%和275.4%。可见，过量表达关键酶基因可以使细胞生物量和NAD+总量得到一定的提高。3株重组菌之间也有一定的差异，其中基因pncB和nadE的过量表达对提高辅酶含量的比例较大，而基因nadD提高辅酶的幅度稍小。
| Recombinant strains | OD 600 | Biomass/(g DCW/L) | NAD+ content/(μmol/g DCW) | Relative ratio/% |
| E. coli BL21/pET-21a E. coli BL21/pET-21a-pncB E. coli BL21/pET-21a-nadD E. coli BL21/pET-21a-nadE |
1.29±0.07 1.75±0.08 1.85±0.07 1.82±0.17 |
1.40±0.03 1.69±0.04 1.72±0.07 1.71±0.13 |
3.78±0.37 13.31±1.20 7.63±0.08 14.19±0.69 |
100.00 352.35±31.73 201.67±16.92 375.40±18.11 |
2.2 NAD+合成途径中2个关键基因共表达的克隆及表达
为进一步提高胞内NAD+的含量，采用共表达策略，利用重叠延伸PCR技术构建重组质粒pET-21a-pncB -nadD、pET-21a-nadD -nadE、pET-21a-pncB -nadE和pET-21a-nadE -pncB。
经限制性内切酶Bam H I和Xho I双酶切鉴定(图 4)，5000 bp左右的条带为质粒骨架pET-21a而稍小的条带为目的基因。经过测序比对，目的条带序列与已公布的匹配一致，共表达重组质粒构建成功。
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| 图 4 双酶共表达重组质粒的酶切验证Figure 4 Identification of the co-expression recombinant plasmid by enzyme digestion. Lane 1: pET-21a-pncB -nadD; lane 2: pET-21a-nadD -nadE; lane 3:pET-21a-pncB -nadE; lane 4:pET-21a-nadE -pncB; M: DL5000 DNA marker. |
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图选项
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离心收集共表达重组菌株细胞，测定其胞内辅酶NAD+的含量和细胞干重(表 3)，重组菌E. coli BL21/pET-21a-nadE-pncB胞内NAD+含量进一步提高，而E. coli BL21/pET21a-pncB -nadD胞内的辅酶含量比较低，结合SDS-PAGE图(图 5)发现基因pncB编码的NAPRTase和nadD编码的NAMNAT表达量较低。
| Recombinant strains | OD 600 | Biomass/(g DCW/L) | NAD+content/(μmol/g DCW) | Relative ratio/% |
| E. coli BL21/pET-21a | 1.29±0.07 | 1.40±0.04 | 3.82±0.27 | 100 |
| E. coli BL21/pET-21a-pncB -nadD | 2.02±0.12 | 1.75±0.14 | 5.67±0.21 | 148.43±5.50 |
| E. coli BL21/pET-21a-nadD -nadE | 1.81±0.07 | 1.68±0.16 | 14.21±0.58 | 371.99±15.18 |
| E. coli BL21/pET-21a-pncB -nadE | 1.82±0.06 | 1.60±0.10 | 16.33±0.93 | 427.49±24.34 |
| E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB | 1.65±0.09 | 1.57±0.15 | 19.30±0.65 | 505.23±17.02 |
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| 图 5 双酶共表达重组菌株的SDS-PAGE分析Figure 5 SDS-PAGE analysis of recombinant strains for double-enzyme co-expression. Lane 1: BL21/pET-21a; lane 2: BL21/pET-21a-pncB; lane 3: BL21/pET-21a-nadD; lane 4: BL21/pET-21a-nadE; lane 5: BL21/pET-21a-pncB -nadD; lane 6: BL21/pET-21a-nadD -nadE; lane 7: BL21/pET-21a-pncB -nadE; lane 8: BL21/pET-21a-nadE -pncB; M: protein cellular marker. |
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图选项
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与E. coli BL21/pET-21a相比，NAD+合成途径中关键酶组合共表达后，对于NAD+的含量和细胞干重产生了不同的效应。在生物量上，与E. coli BL21/pET-21a相比，共表达双基因重组菌均有所提高。在NAD+含量上，重组菌株虽然均有所提高，但是它们之间也存在较大的差异性。E. coli BL21/pET-21a-pncB -nadD胞内NAD+含量相对比例为148%，略低于单个表达基因pncB和nadD；E. coli BL21/pET-21a-nadD -nadE胞内NAD+含量相对比例为372%，与过表达单个基因nadE时提高了2.75倍基本一致；而E. coli BL21/pET-21a-pncB -nadE和E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB都具有叠加效应，比单个基因过量表达时效果更好，这两者之间由于次序不同，NAD+含量相差3 μmol/g DCW，提高的比例相差77.7%，E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB相对E. coli BL21/pET-21a-pncB -nadE提高了18.2%。
2.3 诱导条件对NAD+合成的影响重组菌株中E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB合成NAD+的能力最强，为了探究诱导条件对该重组菌株胞内NAD+合成积累的影响，对诱导条件进行优化，包括诱导温度、诱导时机、诱导时长和IPTG添加量。
测定不同诱导温度下E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB的NAD+含量(图 6-A)，发现诱导温度对辅酶含量影响很大。诱导温度高于25 ℃时，NAD+的含量下降明显。过高的诱导温度会影响酶的活性和表达，导致关键酶NAPRTase和NAD+synthetase表达不正常，影响NAD+的合成[14]。当诱导温度维持在15-20 ℃之间，辅酶含量较高，且波动较小，表明低温有利于胞内NAD+的合成和积累。
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| 图 6 诱导条件优化对NAD+含量的影响Figure 6 Effect of inducing conditions optimization on the content of NAD+. A: effect of induction temperture on NAD+ content. B: effect of induced occasion on NAD+ content. C: effect of induction duration on NAD+ content. D: effect of IPTG content on NAD+ concentration. Standard deviation is the dispersion degree of 3 parallel experimental data relative to mean value. Data in A, B, C and D are the mean±S.D. of triplicate samples. |
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图选项
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不同浓度的诱导剂对E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB胞内NAD+的影响较大(图 6-D)，发现随着IPTG添加量的增加，NAD+含量的变化趋势是先增加后降低，当IPTG浓度达到0.6 mmol/L时，NAD+含量到达较大值，IPTG浓度维持在0.4-0.8 mmol/L时，NAD+含量能够稳定在30 μmol/g DCW。
诱导时机和诱导时长对NAD+含量也有一定的影响(图 6-B/C)，在OD600为0.6时诱导最佳。诱导培养24 h辅酶含量达到较大值，随着时间继续延长，辅酶的含量开始下降。发酵后期培养时间过长，不仅造成培养基中的营养物质不足，大肠杆菌生长受到抑制，而且随着代谢副产物的大量生成，会不断消耗NAD (H)[21]。因此，控制诱导时长对辅酶NAD+的积累量有重要意义。
2.4 前体物质对NAD+合成的影响NAD (H)从头合成途径是以天冬氨酸、色氨酸或者喹啉酸为前体，而补救合成途径中是以烟酸和烟酰胺作为烟酸单核苷酸(NaMN)的前体，进一步合成NAD+。因此，添加终浓度为20 mg/L的前体物质：色氨酸、天冬氨酸、喹啉酸、烟酸和烟酰胺，分别测定胞内辅酶NAD+含量以及生物量的变化情况。
由表 4可知，添加不同的前体物质，对共表达重组菌E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB胞内NAD+的含量均有一定的影响，其中添加烟酸的效果最为明显，较空白对照组提高69.4%。当细胞内大量存在上述NAD+前体时，补救途径中被强化的关键酶NAPRTase和NAD+ synthetase，大量利用前体物质重新合成NAD+。
| Different precursors | c(NAD+)/(μmol/g DCW) | Biomass liveweight/(g DCW/L) | Relative ratio/% |
| Control group | 18.98±0.93 | 1.23±0.05 | 100 |
| Tryptophane | 23.53±1.33 | 1.01±0.04 | 123.97 |
| Aspartic acid | 25.39±1.10 | 1.14±0.07 | 133.77 |
| Quinolinic acid | 27.96±0.91 | 1.12±0.07 | 147.31 |
| Nicotinamide | 29.64±1.27 | 1.13±0.06 | 156.16 |
| Nicotinic acid | 32.16±1.28 | 1.24±0.06 | 169.44 |
优化烟酸的添加量(图 7)，当烟酸浓度为15-20 mg/L时，NAD+含量维持在32 μmol/g DCW左右，而当添加的烟酸超过20 mg/L后NAD+含量逐渐下降。随着烟酸浓度的增加，整个培养基的pH值也有一定的降低，烟酸含量超过40 mg/L时，pH降低至6.5左右。因此，控制烟酸的添加量是提高胞内辅酶含量要考虑的重要因素之一。
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| 图 7 不同浓度烟酸对NAD+含量的影响Figure 7 Effect of different concentrations of nicotinic acid on the NAD+ content. Standard deviation is the dispersion degree of 3 parallel experimental data relative to mean value. Data in figure is the mean±S.D. of triplicate samples. |
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图选项
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2.5 响应面优化NAD+合成的发酵条件
2.5.1 响应面试验设计与结果分析: 在单因素优化结果的基础上，选择对NAD+含量影响较大的3个因素(IPTG浓度、烟酸浓度和诱导时长)，取-1、0、1代表量的3个水平，以NAD+含量为响应值建立二次响应面分析模型。共进行17个试验，其中12个为析因点，5个为零点用于估算误差。每个试验重复3次，实验结果表示为测定结果的平均值正负标准偏差。响应面因素与水平见表 5。
| Factors | Level | ||
| -1 | 0 | 1 | |
| c(A-IPTG)/(mmol/L) | 0.4 | 0.6 | 0.8 |
| c(B-Nicotinic acid)/(mg/L) | 10.0 | 15.0 | 20.0 |
| C-induction duration/h | 20.0 | 24.0 | 28.0 |
利用Design-Expert 8.0对响应面实验结果(表 6)进行二次多元回归分析，除去不显著项得到模型的二次多项回归方程为：Y =42.47+1.44 A + 1.37 B -1.26 AC -4.81 A 2-4.47 B 2-1.52 C 2。由表 7可知，模型P < 0.0001，而失拟项不显著(P =0.1853 > 0.05)。同时，复相关系数RAdj2为97.7%，说明该模型具有拟合度好、误差较小的特点，可用于预测NAD+含量的最佳条件。
| Numbers | Factors | NAD+ content/(μmol/g) | |||
| A | B | C | Actual value | Predicted value | |
| 1 | 0 | 1 | -1 | 36.81±0.30 | 37.40 |
| 2 | 0 | -1 | -1 | 35.62±0.32 | 35.26 |
| 3 | -1 | 0 | 1 | 35.90±0.07 | 36.06 |
| 4 | -1 | 0 | -1 | 33.61±0.55 | 33.34 |
| 5 | 1 | -1 | 0 | 32.49±1.57 | 32.82 |
| 6 | 0 | 0 | 0 | 42.38±0.17 | 42.47 |
| 7 | 1 | 0 | -1 | 38.89±0.39 | 38.73 |
| 8 | 0 | 1 | 1 | 38.06±0.26 | 38.22 |
| 9 | 0 | 0 | 0 | 41.98±0.18 | 42.47 |
| 10 | -1 | -1 | 0 | 30.32±0.43 | 30.75 |
| 11 | 1 | 1 | 0 | 36.88±0.29 | 36.38 |
| 12 | 0 | 0 | 0 | 42.75±0.16 | 42.47 |
| 13 | 0 | 0 | 0 | 42.12±0.18 | 42.47 |
| 14 | 1 | 0 | 1 | 36.13±0.31 | 36.40 |
| 15 | 0 | -1 | 1 | 35.42±0.29 | 34.83 |
| 16 | 0 | 0 | 0 | 43.10±0.16 | 42.47 |
| 17 | -1 | 1 | 0 | 33.06±0.27 | 32.73 |
| Source | df | Sum of squares | Mean square | F | P | Significance |
| Model | 9 | 248.30 | 27.59 | 76.49 | < 0.0001 | Significant |
| A-IPTG content | 1 | 16.53 | 16.53 | 45.83 | 0.0003 | |
| B-NA content | 1 | 15.02 | 15.02 | 41.63 | 0.0003 | |
| C-induction duration | 1 | 0.042 | 0.042 | 0.12 | 0.7428 | |
| AB | 1 | 0.68 | 0.68 | 1.89 | 0.2199 | |
| AC | 1 | 6.38 | 6.38 | 17.68 | 0.0040 | |
| BC | 1 | 0.53 | 0.53 | 1.46 | 0.2666 | |
| A2 | 1 | 97.49 | 97.49 | 270.28 | < 0.0001 | |
| B2 | 1 | 84.01 | 84.01 | 232.91 | < 0.0001 | |
| C2 | 1 | 9.75 | 9.75 | 27.03 | 0.0013 | |
| Residual | 7 | 2.52 | 0.36 | |||
| Lack of fit | 3 | 1.68 | 0.56 | 2.65 | 0.1853 | Not significant |
| Pure error | 4 | 0.85 | 0.21 | |||
| Total | 16 | 250.82 |
2.5.2 响应曲面图分析: IPTG添加量、烟酸添加量和诱导时长3个因素间交互作用对NAD+含量的影响如图 8所示。IPTG与诱导时长交互作用对NAD+的影响较大，其曲线图最陡峭，随着IPTG浓度和诱导时长的增加，NAD+含量呈先上升后降低的趋势。然而，AB以及BC之间的交互作用对NAD+含量的曲面图较为平滑，影响不显著。
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| 图 8 3个因素交互作用对NAD+含量影响的响应面Figure 8 Three-dimensional curved surface for effect of 3 factors interaction on NAD+ content. |
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图选项
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2.5.3 验证试验结果: 在实验因素的水平范围内预测菌株E. coli BL21/pET-21a-nadE -pncB胞内NAD+含量的最佳培养条件为：IPTG添加量0.63 mmol/L、烟酸添加量15.8 mg/L、诱导时长为24 h，此时的NAD+含量理论预计值为42.69 μmol/g DCW。在最优条件下进行3次验证试验检验回归方程预测结果，实际得到的NAD+含量为(43.16±0.65) μmol/g DCW，与理论值的平均误差小于5%。试验结果验证了模型所得到的二次多项回归方程可较准确地预测NAD+含量。3 讨论
论文采用单基因过量表达和双基因共表达策略，通过调节表达量考察了合成途径3个关键酶对辅酶NAD+合成水平的影响，研究发现单基因过表达重组菌E. coli BL21/pET-21a-pncB、E. coli BL21/pET-21a-nadD和E. coli BL21/pET-21a-nadE胞内NAD+含量分别提高了252.4%、101.7%和275.4%。三者之间存在的差异可能是由于基因nadD编码的烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(NAMNAT)既可以催化烟酸单核苷酸(NaMN)生成烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)又可以降解NAD+生成烟酰胺单核苷酸(NMN)[13, 22]。结合实验数据和文献，发现基因pncB和nadE提高NAD+含量的能力比基因nadD强。
结合双基因共表达重组菌株的实验数据和NAD+合成路径来看，脱氨基的NAD+在NAD+合成酶催化下氨基化生成NAD+可能直接影响了NAD+的合成量，基因nadE在宿主菌E. coli BL21中对NAD+合成量贡献更大。其中，重组菌E. coliBL21/pET-21a-nadE -pncB的NAD+含量提高405.2%，结果表明在研究对象E. coli BL21中，烟酸磷酸核糖转移酶和NAD+合成酶在NAD+合成途径中起到了关键性的作用。
通过对重组菌株BL21/pET-21a-nadE -pncB的诱导条件和NAD+合成途径的关键前体物质进行研究和优化，增加了蛋白的表达量并保证了菌体生长代谢的良好环境，有利于NAD+含量的增加与积累，使胞内NAD+水平维持在32 μmol/g DCW左右。
利用响应面分析优化IPTG浓度、烟酸浓度及诱导时长，确定最佳发酵条件，当诱导温度控制在15-20 ℃，在OD600为0.6-0.8时添加IPTG0.63 mmol/L，烟酸15.8 mg/L，诱导时长24 h，E. coli BL21/pET-21a-nad E-pncB胞内辅酶含量能达到43.16 μmol/g DCW左右。与未优化前相比，胞内NAD+含量提高了123.6%，与未强化NAD+合成途径的初始菌株E. coli BL21/pET-21a相比提高了1029.8%。对利用细胞自身辅酶NAD+，促进微生物最大化的合成目标代谢产物，增加代谢速率，提高氧化还原反应中生物催化效率具有较好的借鉴性。
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