摘要：对于双向凝胶电泳实验来说最重要的环节就是样品制备，样品的好坏直接关系到整个实验最终的成败。本文将对样品制备进行简要的阐述，并以大肠杆菌细菌为例介绍具体的制备步骤。关键词：双向凝胶电泳；样品制备；大肠杆菌样品制备对于获得理想的结果是至关重要的，但是由于所研究的实验对象不同、采用的技术手段不同、需要达到的目标不同，所以迄今为止并没有一个理想的实验方案能够解决所有问题。由于在目前双向电泳技术仍然是蛋白质组学研究的一个主要技术手段，所以本章将围绕如何制备双向电泳所需要的样品来展开讨论。1 样品制备的原则（1）要注意样品的准确性问题：第一，样本是否处于所需要的状态？例如在研究某种疾病的时候，所要采集的组织是发病的哪个阶段（早期、中期、或者晚期）。第二，采集的样本是否单一？例如在采集肝脏组织的时候是否带有大量血管。（2）要避免蛋白质的丢失：样品制备的操作步骤越少、时间越短越好，这样能有效地减少蛋白质的特异性和非特异性丢失。（3）要避免蛋白质的修饰和降解：使用高质量的试剂，操作尽可能保持低温、快速。（4）样品中的杂质要尽量少：尽可能地除掉脂类、多糖、核酸、盐分等能够对后续实验造成干扰的杂质。2 裂解液在样品制备过程中都需要用裂解液来溶解并提取蛋白质，基本组分有离液剂、表面活性剂、还原剂等物质，一般来说裂解液有以下几方面的作用［1］：（1）将所有蛋白转化为单一构象。（2）去除氧化步骤。（3）防止蛋白质的沉淀。（4）防止蛋白质的修饰。（5）使疏水蛋白质充分并稳定地溶解。（6）灭活蛋白酶。（7）破坏二硫键和疏水键，充分暴露其内部基团。离液剂高浓度的尿素通过破坏蛋白质的二级和三级结构来使疏水蛋白溶解并防止其蛋白质之间的相互作用，硫脲可以增加一些难溶的疏水蛋白质（如膜蛋白）的溶解。单独使用尿素时浓度至少8M（最高可到9.8M），而硫脲的溶解性不好（通常最高2M），所以在一同使用的时候通常尿素的浓度是5-7M，而硫脲是2M。含有尿素的溶液在操作时一定要注意控制温度，温度过高（>37℃）会造成分解，而温度过低可能造成析出。从加水溶解开始，尿素就会在溶液体系中逐步和氰酸铵达成一定的平衡。在37℃以下，尿素的水解很缓慢，对于绝大多数的样品制备程序都不会造成影响。异氰酸会与蛋白质的N末端、赖氨酸、精氨酸的氨基以及半胱氨酸的巯基发生氨甲酰化反应，分子量增加43，反应原理见图1。这些反应的速度依赖于pH值，与脂肪族胺反应的最适pH值是8.5-9.5，而与蛋白质N端的α氨基反应最适pH值为7左右。如果异氰酸修饰了蛋白质的氨基，那么蛋白质所携带的正电荷减少，在2D图谱上会产生向酸性端的偏移。温度不是很高的情况下，会在原蛋白质点偏酸的位置出现横向成串的点。温度过高时，则蛋白质点会聚集在酸性端。由于分子量只增加43，所 以观察不到纵向上的变化。表面活性剂表面活性剂通过破坏离子键和氢键防止蛋白质通过疏水作用聚集，促进但蛋白质的分散和溶解。最初使用的是非离子型的Triton X-100（质谱对于Triton X-100中的杂质非常敏感）和NP-40，然而由于两性离子表面活性剂CHAPS（通常最高使用浓度4%）可以获得很高的纯度，所以得到了广泛的应用。后来又陆续研制出一系列的新型两性离子表面活性剂，如SB 3-10（由于SB 3-10在尿素溶液中不容易溶解，所以一般要求尿素浓度最高5M）、ASB14、C8Ø等［3］。阴离子型的SDS有时也会使用，主要是为了防止寡聚体的形成（如血清中的白蛋白）和溶解一些难溶的疏水蛋白。通常最高使用浓度为2%，但是在等电聚焦（IEF）前必须稀释至少20倍以上（即稀释到<0.1%）。通电后SDS会与蛋白分离，并电泳到阳极端。当SDS不能从蛋白上分离开的时候，会使等电点变得更酸。表面活性剂的作用是同所使用的离液剂体系密切相关的。一般来说兼性离子表面活性剂比中性的好，但是也有例外。有报道显示当单独使用尿素的时候，CHAPS比Triton X-100好，但是当使用尿素-硫脲体系的时候，Triton X-100溶解膜蛋白就要比CHAPS好很多［4］。还原剂为了使许多蛋白质达到完全的去折叠还需要还原二硫键。最初使用β-巯基乙醇，但是由于使用浓度较高，在pH>8时存在一定的缓冲作用，且经常存在角蛋白污染，所以后来经常使用的是巯基型的二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇（DTE）和非巯基型的三正丁基膦（TBP）［5］。在IEF的时候，由于DTT、DTE会带有负电荷，所以造成流失，不能很好地维持还原的环境。TBP由于不带电荷而被普遍认为是一种较好的替代品。蛋白酶抑制剂细胞中有很多蛋白酶能够对蛋白质进行降解，在破碎细胞的时候尤其严重。虽然添加硫脲也能有效抑制蛋白酶活性［6］，但是蛋白酶比一般的蛋白更能抵抗变性剂的作用，有些蛋白酶在高浓度的尿素和硫脲存在下仍然可以保持部分活性。使用SDS或者TCA沉淀的时候能够较为彻底地灭活蛋白酶［7］。不加蛋白酶抑制剂经常会造成高分子量蛋白的丢失，所以制备样品时间较长的情况下（如分级提取）一定要加。有时虽然在提取的过程中降解不严重，但是在IEF过程中会使降解增加［8］，一般在水化液中加入蛋白酶抑制剂和使用杯上样会解决这一问题。要注意的是目前没有一个特别确保灭活所有蛋白酶的好方法，而且某些蛋白酶抑制剂可能会修饰蛋白［1］。核酸酶在使用超声破碎制备一些核酸含量不高的样品的时候核酸会被打碎，不用添加核酸酶。但是对于一些核酸含量特别高的样品，经常需要使用核酸酶。核酸酶降解核酸的效率很高，在裂解液体系中，由于核酸呈变性的状态，所以更易于被核酸酶消化掉。尽管核酸酶自身在较短的时间内（约10-15分钟）也会变性，但是对于降解核酸已经足够了［9］。需要注意的是DNA酶的活性需要镁离子且核酸酶会出现在最终的电泳胶图上。载体两性电解质有些蛋白质的溶解需要一定的离子强度，而载体两性电解质可以增加缓冲能力和离子强度，所以常用于增强蛋白质的溶解性。由于其运动到等电点时变成不带电的状态，所以不会干扰IEF。特定的加到IPG中的载体两性电解质被称作IPG Buffer（通过对一般的载体两性电解质进行改造所获得，优点是不会在银染时造成背景），使用不同的载体两性电解质组合会得到不同的结果，具体的比例需要针对不同样品通过实验进行摸索。一般来说宽pH梯度的载体两性电解质可以用于窄pH梯度的胶条（如pH 3-10的IPG buffer用于pH 4-7的胶条），但是反之则不行［1］。指示剂指示剂用于判断聚焦是否开始并正常，通常使用溴酚兰，也可以用Orange G代替，少量使用的情况下不会对IEF形成干扰。此外，有文献报道用考马斯亮蓝（CBB R-250，使用浓度0.01%）替代溴酚兰会改善电泳图谱上点的质量，特别是在碱性pH梯度的区域。原因可能是改善了蛋白的溶解性并增强了转二向的效率［10］。Tris在溶解蛋白的裂解液中经常会加入微量的Tris（通常<40mM）来使溶液呈碱性，其作用主要是（1）有些蛋白酶在碱性条件下会被抑制（2）烷基化和二硫键的还原也需要碱性的环境（3）碱性环境下许多蛋白质呈阴离子形式，难于同核酸相结合（4）由于大多数蛋白质的等电点是偏酸性的，所以碱性环境有助于蛋白质的溶解（5）有些蛋白质需要一定的离子强度来增强溶解性。不同样品所需最适pH不一样。需要注意的是在水化上样之后开始IEF的时候，Tris会迅速聚集到一个区域（例如18℃时在pH8.3附近，与其pKa值有关）形成离子边界，使这一区域的电导升高，此时移动能力不强的碱性蛋白便聚集在这一边界附近而无法移动到正确的位置。杯上样时在阳极端上样也可能出现同样的问题，因为Tris的移动非常快，最终可能会造成蛋白质的沉淀。当然，这一问题的严重程度与样品的性质相关，例如大肠杆菌中碱性蛋白较少，那么Tris的影响就相对较小（20mM时没有明显的影响）［11］。这个问题可以通过稀释、超滤或者沉淀来解决。精胺在制备样品的时候有时会用到精胺，因为精胺能够与核酸结合形成复合物沉淀，然后可以通过离心去除。此外，由于精胺同核酸的结合，能够释放出一些平时同核酸结合在一起的蛋白［9］。3 样品的破碎为了提取蛋白质，经常需要将组织或细胞等进行破碎，通常使用的方法有冻融法、酶法和机械破碎法。冻融法效率低，很少采用；酶法破碎比较温和，但是由于效率不高且引入外源蛋白质而很少采用；机械破碎依靠高能量，不会引入其它的化学物质或者酶等，但是有可能造成目的蛋白质的破坏。机械破碎通常是依靠液体的剪切力、细胞内外的压力差以及玻璃珠或者刀片的碰撞力等，具体方法主要有玻璃珠法、匀浆法、压力破碎、超声波破碎等。玻璃珠法操作简便，适用体积范围较大（0.2-50ml），适用于多种样品；匀浆法主要用于处理组织、植物样品等，处理量不能太大；压力破碎常用于处理细菌、细胞及酵母等样品，操作时需要注意蛋白的氧化降解；超声波破碎较为常用，但是容易造成样品的过热。此外，超声还可能会破坏分子簇之间的非共价结合（比如酶复合物），在研究复合物的时候需要引起注意［12］。4 分级分离由于受到方法学上的限制，双向电泳只能在有限的动态范围内来分析蛋白质。为了降低样品的复杂性并研究那些低丰度蛋白质，通常需要在制备样品的时候采用分级分离的手段。分级分离的手段多种多样，包括多种色谱技术、制备型IEF、超滤、亚细胞分级分离等，可以将蛋白质按照性质不同以及细胞定位的不同等依次分离。常见的例子有利用分别适合于溶解不同亲水性蛋白质的裂解液提取蛋白，利用超速离心等手段收集细胞器，利用亲和层析、免疫共沉淀等去除高丰度蛋白（如血液样本中的白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白等），富集磷酸化蛋白、糖蛋白等。需要注意的是，处理的步骤越多可能造成的问题也越多，例如使用色谱分离的重复性问题、制备型IEF时蛋白质暴露在高浓度尿素溶液中的时间过长的问题，富集特定蛋白质的过程中蛋白质丢失的问题。5 杂质的去除需要去除的杂质通常是指能够对双向电泳造成干扰的一些物质。盐分能够使导电性增加从而影响聚焦；核酸能够影响IEF的酸性端聚焦表现、增加样品的粘度并影响裂解的效果；多糖能够堵塞IEF凝胶的孔隙造成沉淀从而干扰聚焦且增加样品的粘度；酚类物质可以修饰蛋白质并使其溶解性下降；脂类会同蛋白质结合形成不溶的复合物［13］。常用的去除杂质并浓缩样品的方法有透析、超滤、沉淀以及凝胶过滤等。透析法操作时间长、难于自动化、操作体积大、需要再浓缩，可能会造成蛋白的降解或丢失，所以较少采用。超滤法可去除高分子量的多糖和盐，问题是在蛋白浓缩的同时一些高分子量的杂质也会被浓缩。当不存在同所需蛋白质无法区分的杂质且样品浓度过稀的时候可以选择超滤这一手段，但是要注意选用同蛋白质结合能力很低的滤膜［14］。沉淀法有硫酸铵沉淀、三氯乙酸（TCA）沉淀等，由于TCA沉淀能够有效地去除杂质，所以得到了普遍的应用，其缺点是不可逆变性和蛋白质重溶解困难。TCA沉淀曲线是U型的，在很低浓度（大于5%）和很高浓度（大于50%）的时候蛋白质都倾向于溶解，所以在15-40%的浓度能够沉淀绝大多数的蛋白。 一般来说TCA/丙酮沉淀比单独使用TCA或丙酮的效果好，但是沉淀的蛋白质重新溶解的时候要比丙酮沉淀困难一些，此外要注意，TCA沉淀可能会造成酸诱导的蛋白水解［15］。6 实验方案举例A：大肠杆菌全菌体蛋白样品的制备（1）取100ml菌液，5000g离心10min，弃上清。（2）低盐清洗缓冲液(3 mM KCl, 1.5mM KH2PO4, 68mM NaCl, 9 mM NaH2PO4)洗菌体三次，每次20ml。离心条件同上，最后残余的液体应尽量用Tip头（或者干净的滤纸条）吸尽。（3）用1.5ml纯水重悬菌体并转入10ml烧杯中。加入2.1g尿素，0.2g CHAPS，0.762g 硫脲和38.5mg DTT（终浓度分别为7M、4%、2M和50mM），加入全效蛋白酶抑制剂1片，轻轻吹打使之完全溶解后定容至终体积为5ml。（4）冰浴超声5分钟至液体澄清（超声仪SONICS VC 750，最大功率的25%，脉冲2秒，停2秒，需要注意的是一定不要起泡沫，如果在超声的时候出现大量泡沫应该立刻停止，等泡沫消除之后再超声），加入2.5mgRNase A和100单位DNase I，室温放置一小时以使蛋白质充分溶解。（通常来说如果超声比较彻底，不加核酸酶也可以）（5）15℃，40000g 离心30min去除不溶性沉淀，取上清测定蛋白质浓度。B：大肠杆菌外膜蛋白样品的制备［16］使用碳酸盐提取细菌的膜蛋白是一种常见的且比较温和的方法，该方法基于碳酸钠的强碱性来溶解并去除那些松散结合于细胞膜上的其它蛋白质，而含有膜内在蛋白以及一些脂蛋白的细胞膜在碳酸盐溶液中不能溶解，这样就可以通过离心来回收。使用2-DE裂解液将其溶解后即可用于常规的蛋白质组学实验进行分析。相对于梯度密度离心来说，该方法的优点在于能够有效去除高丰度的胞质蛋白（如延伸因子、核糖体蛋白等）。（1）取200-400ml菌液，2500g离心8min。（2）去除培养基，用20ml的50mM Tris-HCl（pH7.5）轻轻地重悬。（3）2500g离心8min。（4）去上清，按照每20mg总蛋白重悬于含有0.7mg DNase I的50mM Tris-HCl（pH7.5）中。（100ml过夜菌总蛋白含量大约为50mg）（5）在预冷的French Press中9.65×107Pa（14000psi）破碎2次。（可以用超声破碎代替）（6）2500g离心8min去除未破碎的菌体（破碎后应该在显微镜下检查菌体是否破碎完全，如不完全则需要再次破碎），上清用于碳酸盐提取。（7）将上清加入到50ml冰预冷的100mM碳酸钠水溶液中（pH值约为11，溶液配好后不需要调整其pH值，使用前4℃至少预冷1小时），冰浴下缓慢搅拌1小时。（8）在4℃、115000g超速离心1小时收集细胞膜。（作预实验的时候可以使用普通的离心机来完成此步操作）（9）去上清，用2ml的50mM Tris-HCl（pH7.5）清洗沉淀。（要彻底洗掉碳酸钠）（10）重复步骤（8）收集沉淀，即细胞膜。（11）用1.2ml裂解液［7M 尿素 / 2M 硫脲 / 1%(w/v) ASB14（amidosulfobetaine 14） / 0.5%(v/v) Triton X-100 / 30mM DTT / 40mM Tris碱 / 0.5% Biolytes pH3-10(与使用的胶条相对应)］溶解膜蛋白，最终蛋白质浓度大约为1mg/ml。（如果溶解效果不好可以轻微超声来助溶）
