饲料酶制剂为饲料业发展水平的提高提供了条件。我国饲料以玉米为主，玉米中含有大量淀粉，通过α-淀粉酶的协调作用，使淀粉预降解，既达到了切断长链淀粉的作用，又减少了黏度，加快了饲料的催化，从而提高了饲料的转化效率，为此α-淀粉酶在饲料酶中占据着很重要的地位。为提高α-淀粉酶发酵活力，我们以HG67（平均发酵活力537μ/ml）为出发菌株，通过多因素连续处理方法选育高产α-淀粉酶菌株，获得一稳定高产菌株SL105,并对其进行了发酵条件试验。
1 材料与方法
1.1 菌株
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产α-淀粉酶生产菌株HG67。
1.2 培养基及培养条件
1.2.1 分离培养基
马铃薯淀粉2%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH 7.0，1kg/cm2 表压下灭菌30min，37℃培养48h。
1.2.2 肉汤培养基
牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 7.0。
1.2.3 液体培养基
葡萄糖5%，牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 7.0。
1.2.4 传代及保藏培养基
称取洗净去皮的土豆200g，切成薄片后，加水煮沸半小时，过滤定容至1 000ml，加硫酸镁5mg，pH调至6.7，1kg/cm2 表压下灭菌30min，37℃培养72h。
1.2.5 摇瓶发酵培养基
玉米粉9%，豆饼粉5%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，无水氯化钙0.2%。500ml三角瓶装40ml，自然pH，6层纱布扎口，1kg/cm2 表压下灭菌30min。37℃往复式摇床培养46h，摇床频率160次/min，振幅7cm。
1.3 诱变及选育方法
1.3.1 60Coγ-射线处理
将出发菌株接入40ml肉汤的500ml三角瓶中，37℃摇床培养12h，取1ml培养液转接于40ml肉汤的500ml三角瓶中，同样条件下继续培养4h至对数期，4 000r/min离心收集菌体，生理盐水洗涤3次，制备菌悬液。进行60Coγ-射线处理。再次转接入肉汤培养基，培养、离心、洗涤，用pH6.0的磷酸缓冲液制成菌悬液。
1.3.2 NTG诱变
取上述菌悬液加NTG至200μg/ml浓度，摇床培养30min。离心收集菌体，生理盐水洗涤，转接入肉汤培养基增殖培养。
1.3.3 菌种的加热选育
将上述肉汤培养基增殖液接入液体培养基中，37℃增殖30h，于100℃水浴加热5min、激冷。取加热后菌悬液1ml加入同前的液体培养基，培养，再次热处理。如此反复4~6次，并进行培养基平板培养和分离。这样以来可以得到均匀的菌悬液，且可以灭掉一些不健壮的菌体及可能存在的噬菌体。
1.3.4 菌株筛选
1.3.4.1 初筛 将涂布的分离培养基平皿37℃培养48h，把培养好的平板菌落先放入4℃冰箱中冷藏过夜，这样无需“刘哥氏碘液”显色便可清楚地观察到透明圈，测定透明圈直径与菌落直径之比，以此比值来初步衡量α-淀粉酶产酶能力的高低，挑选单菌落进入斜面，进行复筛。
1.3.4.2 复筛 将初筛选出的菌株转入摇瓶发酵培养基，500ml三角瓶装40ml，37℃往复式摇床培养48h。
1.4 酶活测定
采用中国轻工业部部颁标准（QB1805.1—93）测定。
2 试验与结果
2.1 菌株诱变结果
经60Coγ-射线，NTG和热处理后，经初筛和复筛，选育出5株高活力产淀粉酶菌株，并进行发酵条件试验，结果见表1。
由表1可见，变异菌株SL105产酶最高，达761μ/ml，比亲株提高41%。
2.2 菌株特性
2.2.1 菌株产酶稳定性试验
对高产菌株的稳定性进行了考察，SL105株连续传五代，五代菌株同时进行摇瓶发酵试验，每个菌株5个重复，结果取平均值，菌株发酵48h后的H26菌株稳定性试验结果：1～5代酶活（μ/ml）分别是748、755、763、749、757。从中可以看出，SL105株传代5次产酶能力变化不大，说明其遗传性比较稳定。
2.2.2 菌株形态特性
菌形为短杆状，两端钝圆，单独或成对生长，呈短链。在淀粉培养基上菌膜较厚，但产孢子较少，在土豆培养基上几乎全部形成孢子，芽孢在菌体中央。菌丛乳白色，菌落圆形，光滑无皱，有粘稠性，淀粉水解圈大。
2.3 产酶条件试验
2.3.1 发酵最初pH值对SL105产酶的影响
为考察SL105发酵培养基最初pH值对产酶的影响，将灭菌前培养基调节不同的起始pH值，进行摇瓶发酵，比较酶活力高低，结果见图1。
由图1可见，发酵培养基pH7.0时发酵活力最高，定为最适产酶pH值。
2.3.2 发酵培养基组成试验
2.3.2.1 不同种类碳源对产酶的作用
在以豆饼粉为氮源的情况下，试验了淀粉、糊精、液化的玉米粉和不经液化的玉米粉等碳源对α-淀粉酶产量的影响见表2。
由上表可见，玉米粉效果较好且相对较廉价，是较理想的碳源，其中液化的玉米粉更佳。液化条件：先将玉米粉糊化，加入α-淀粉酶0.06%，75℃液化30min，再升温灭活，然后加入豆饼粉及无机盐类。
2.3.2.2 不同浓度的碳氮源配比试验
为确定SL105菌种发酵培养料最适浓度的碳氮比，进行了以玉米粉为碳源、豆饼粉为氮源的配比试验。其结果见表3。
由表3可见，以玉米粉11%和豆饼粉5%组成的发酵培养基发酵活力最高，定为最适碳氮比。
2.3.2.3 玉米浆对发酵活力的影响
玉米浆为含氮及营养丰富的物质，我们在培养基中添加一定量的玉米浆，考察其对发酵活力的影响，结果见表4。
结果表明，在培养基中添加1.5%浓度的玉米浆对发酵活力有促进作用。
2.3.3 通风量试验
α-淀粉酶发酵是耗氧过程，通风量对微生物生长及产酶有极大影响。在摇瓶培养情况下,培养瓶的形状、瓶口大小、装液量、包扎瓶口纱布的层数、摇瓶方式、转速与振幅都可影响培养基的溶氧量。我们发现在相同条件下，采用往复式摇床比旋转式摇床（210r/min，偏心距5cm）的发酵活力要高。考虑到使用往复式摇床，其氧吸收系数较旋转摇床高，说明此菌株要求较高的通风量，我们在往复式摇床上使用500ml三角瓶，通过装料量的不同进行通风量的进一步试验，结果见图2。■
装料量（ml）
试验结果进一步表明，该菌株在良好的通气条件下，酶活较高，500ml摇瓶装量采用30ml为宜。
2.3.4 最佳产酶条件试验
以玉米粉11%，豆饼粉5%，玉米浆1.5%为基础料配制培养基，500ml三角瓶装料30ml，调pH7.0，在适宜的浓度下，培养温度37℃，摇瓶发酵48h时，3批重复试验结果(表5)表明，变异菌株SL105有较高的产酶活性，平均酶活达761μ/ml。
3 讨论
3.1 菌落形态
在菌种诱变和筛选过程中，出现了两种菌落形态。一种边缘整齐，质地粘稠，称为光滑型；另一种边缘不整齐，质地不粘，称为粗糙型。光滑型菌落数量较多，我们在挑选菌落时也以光滑型为主并得到了高产菌株，但粗糙型菌落由于挑选较少，并不能证明菌落形态与产酶之间的相关性，此工作有待大量试验的证实。
3.2 透明圈
在菌种初筛时，一般认为透明圈大即产酶高，圈不大就被淘汰，我们发现透明圈与酶活之间不是很规律性的东西，有的菌落透明圈虽然不大，但酶活并不低。所以，菌落的优劣应以多次发酵摇瓶的验证为准。
王健华，河北省邢台市酶制剂厂，工程师，054001，河北邢台。
朱宝成，河北大学生命科学学院。
收稿日期：2005-03-25
