饲料α-半乳糖苷酶活力测定方法的研究

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摘  要：根据含α-半乳糖苷键及其结构组成，可分为三种饲用α-半乳糖苷酶活性的检测程序：以蜜二糖为底物的葡萄糖氧化酶法，测定步骤较繁杂，一般较少采用；以棉籽糖为底物的DNS法，因饲料中干扰因素较多，导致酶活性偏低；而以对硝基苯酚-α-D-半乳糖吡喃糖苷为底物的p-NPG法，具有操作简便，灵敏度高，重现性好等特点，得到较广泛应用。

1  前言

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，E.C. nth="12" year="1899">3.2.1.22)广泛存在于动植物和微生物中，以外切的方式水解α-1,6半乳糖苷键，从寡糖或多糖的α-1,6非还原性半乳糖糖苷残基处水解，如棉籽糖类寡糖（蜜二糖、棉籽糖、水苏糖和毛蕊花糖）和半乳甘露聚糖等。用作饲料原料的豆科类饲料如豆粕、棉籽粕、菜粕以及甜菜渣含有α-半乳糖苷类寡聚糖。对于单胃动物（如猪和禽）及幼龄反刍动物，其胃肠道缺乏水解这类抗营养因子的α-半乳糖苷酶，导致消化紊乱，引起胀气或腹泻，营养物质的利用率也下降。饲用α-半乳糖苷酶能较好地消除α-半乳糖苷类引起的抗营养作用。国内外市场已经出现同类产品，但是由于没有统一的检测标准，所以报道的酶活力可比性差。

2  α-半乳糖苷酶的检测方法

根据蜜二糖和带α-半乳糖苷键的低聚糖的结构，可用作α-半乳糖苷酶测定的底物有蜜二糖、棉籽糖、水苏糖及对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖等，由此可建立以下三种相应的α-半乳糖苷酶的方法。

2.1  葡萄糖氧化酶法

以蜜二糖为底物，用葡萄糖氧化酶氧化蜜二糖水解产生葡萄糖，再用Warburg氏压力计（Warburg manometer）测定其含量。该方法由于需用葡萄糖氧化酶及Warburg氏压力计，且测定步骤较繁杂，一般较少采用。

2.2  Somogyi-Nelson法即还原糖法

以棉籽糖或水苏糖为底物，经酶解后用Somogyi-Nelson法测定还原糖含量，由计算还原糖的增量而获得α-半乳糖苷酶活力。也有报道改用与其测定原理相同，而运用操作较简便的DNS法测定还原糖含量。酶活单位定义：在合适反应条件下，每分钟分解棉籽糖生成相当于1μmol葡萄糖所需的酶量为1个α-半乳糖苷酶活力单位。

这种方法可能由于酶样品未经纯化处理，其中的干扰因素较多，影响了酶与底物的结合，降低了还原糖的释放，会导致酶活性偏低。

2.3  对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖(p-NPG)法

以对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖(p-NPG)为底物，经酶解后测定释放的对硝基酚含量，获得α-半乳糖苷酶活力。酶活单位定义：在合适测定条件下，每分钟分解对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖生成1μmol对硝基酚所需的酶量为1个α-半乳糖苷酶酶活单位。

此测定方法因酶样品中与底物的类似物几乎没有，酶受干扰程度较少，酶的活性部位与底物得以充分结合，使酶解释放的产物对硝基酚大幅度增多，能较真实地反映α-半乳糖苷酶的活性。高红伟等人对该方法进行了反应条件的优化，如批间和批内精密度、线性关系及灵敏度和回收率试验，证实此检测方法具有操作简便，灵敏度高，重现性好等特点。

由于对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖(p-NPG)方法有以上优点，被广泛地使用在饲用α-半乳糖苷酶酶活的检测中。影响饲用酶制剂活力的因素，除了酶和底物的反应条件，如pH、温度和时间，酶的前处理方法(稀释度、浸泡液pH、离子强度和搅拌状态等)都将直接或间接影响产品酶活测定值。潘宝海等研究酶浓度、反应体系pH、反应时间对α-半乳糖苷酶活力测定值的影响，并考虑到饲用酶制剂的作用环境，建立了一种简捷和准确的饲用α-半乳糖苷酶测定方法：样品酶稀释到酶活低于2.0 U/mL，反应体系pH约为5.0，温度value="37" unitname="℃">37℃，反应时间6 min。王春林等通过对饲用型青霉α-半乳糖苷酶活力测定方法的研究指出，稀释倍数和pH对酶活力的的影响较为显著，建议测定用稀释酶液的活力为0.02-0.07 U/mL，反应体系的pH为5.5，温度value="40" unitname="℃">40℃，作用时间10 min，在405 nm波长比色测定。高红伟等认为底物的浓度为2 mmol/L，最适反应pH为6.4，反应温度为value="26" unitname="℃">26℃，酶促反应时间为10 min为最优α-半乳糖苷酶活力测定条件。许尧兴等通过反应条件优化，得出对硝基苯酚-α-D-半乳糖吡喃糖苷底物的p-NPG法的测定条件为反应体系pH 4.0，反应温度value="40" unitname="℃">40℃，反应时间10 min，底物浓度5 mmol/L。从中可以看出，所得出的α-半乳糖苷酶酶活测定条件都不同，所以要根据不同来源饲用型α-半乳糖苷酶、酶的特性和作用环境等因素制定出合适的检测条件，才能客观地评定酶产品。

3  结语

酶的催化反应动力学研究表明，一种酶的活性只能是在一个特定条件下的反应结果。而这一特定条件主要包括酶的来源、反应体系的温度、pH、反应时间及底物浓度等几个主要因素。通过对影响酶活的各种因子的系统分析，从中选择测定α-半乳糖苷酶的方法。饲用酶制剂的有效作用位点是动物的消化道，其反应的pH和温度与工业酶制剂最高酶活条件有差异。另外，因为饲用酶制剂的载体含量较多，还原糖含量较高，酶活相对较低，酶的稀释倍数对α-半乳糖苷酶检测酶活影响较大，所以第1和第2种方法对此难以准确检测。目前较多的文献报道，饲用α-半乳糖苷酶酶活检测的方法基本是使用对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖法。