细胞内酸性磷酸酶的显示

【 目的要求 】

1、掌握细胞中酸性磷酸酶的显示方法。

2、观察酸性磷酸酶在细胞中的存在部位。

【 实验原理 】

细胞中存在着能分解磷酸酯的酶，它们可分为一磷酸酯酶、二磷酸酯酶和三磷酸酯酶等三类，其中最主要的是一磷酸酯酶。这类酶按最适pH值又可分为两类，一类在pH9.5左右的条件下发挥作用，称为碱性磷酸酶；另一类在pH5.0左右的条件下发挥作用，称为酸性磷酸酶。当酸性磷酸酶与含有磷酸酶的作用底物（如甘油磷酸钠）一起保温时，能水解磷酸酯使其释放出磷酸基，磷酸基进而与底物中存在的铅盐结合形成无色的磷酸铅（PbHPO4）沉淀物，当用黄色的硫化铵作用该沉淀时可形成黄棕色或棕黑色的硫化铅沉淀；从而使细胞中酸性磷酸酶显示出来。本实验项目以小鼠腹腔巨噬细胞为材料显示该酶的存在。

【 器材与试剂 】

1、器材：显微镜、恒温水浴锅、注射器、盖玻片、载玻片、剪刀、镊子、酒精灯等。

2、材料：小白鼠。

3、试剂：6%淀粉肉汤、0.85%生理盐水、酸性磷酸酶工作液、福尔马林、钙固定液、2%硫化铵溶液、甘油明胶封固剂。

4、试剂的配制

（1）6%淀粉肉汤：称取牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化钠0.5g加入到100ml蒸馏水中溶解，再加入可溶性淀粉6g，温浴溶解，煮沸15分钟灭菌，置4°C冰箱中保存，使用时水浴融化。

（2）0.85%生理盐水：称取8.5gNaCl溶于1000ml蒸馏水中。

（3）酸性磷酸酶工作液：

① 0.05mol/L醋酸缓冲液：先用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中均匀混制成0.2mol/L的醋酸液（A液），再称取醋酸钠（NaAc·3H2O）2.72g溶于100ml蒸馏水中配成0.2mol/L的醋酸钠溶液（B液）。取A液30ml加B液70ml混匀即成0.05mol/L醋酸缓冲液，置4°C保存。

② 3%β-甘油磷酸钠溶液：称取β-甘油磷酸钠3g溶于100ml蒸馏水中，4°C保存。

③ 工作液：临用时，称取硝酸铅25mg,溶于22.5ml的0.05mol/L醋酸缓冲溶液中，待全部溶解后，再缓慢地滴加入3%的β-甘油磷酸钠液2.5ml，同时快速搅动，防止产生絮状物。

（4）福尔马林·钙固定液：先称取无水CaCl2 10g溶于100ml蒸馏水中配成10%氯化钙溶液，取该液10ml加入到80ml蒸馏水混匀，即成福尔马林·钙固定液。

（5）2%硫化铵：量取2ml硫化铵加入到98ml蒸馏水中，现配现用。

（6）甘油明胶封固剂：称取明胶7g加入42ml蒸馏水中，水浴加温溶解，再加入50ml甘油并搅匀，另加少许麝香草酚作防腐剂，置4°C贮存，使用水浴加温融化。

【 内容与方法 】

1、取20g左右小白鼠一只，每日往其腹腔注射6%淀粉肉汤1ml，连续三天。

2、在第三次注射后3~4小时，再向腹腔注射生理盐水1ml。

3、过3~5分钟后取腹腔液0.1~0.3ml（注意抽取部位要尽量与注射部位相一致，否则难以抽出）或用颈椎脱臼法处死小白鼠后，打开腹腔，用注射器（不装针头）直接吸取腹腔液。

4、往预冷的盖玻片上滴一滴腹腔液，立即用牙签涂后放入小培养皿4°C冰箱中30分钟，使细胞自行铺展开。

5、冷风吹干玻片，如室温低于20°C，可任其自然干燥。

6、往盖玻片上滴加酸性磷酸酶工作液两滴（或将玻片插入盛有酸性磷酸工作液的小染色缸中），37°C温育30分钟。

7、取出盖玻片用蒸馏水冲洗，然后立于吸水纸上吸去多余水分。

8、放入盛有10%福尔马林·钙固定液的小染色缸内处理5分钟，进行后固定。

9、取出玻片，在蒸馏水中漂洗，再吸去多余水分。

10、放入2%硫化铵溶液中处理3~5分钟。

11、蒸馏水漂洗。

12、取一载玻片，往其中滴一滴明胶甘油封固剂，将带水的盖玻片有细胞的一面朝下，慢慢盖向载玻片上的明胶甘油，使盖玻片封固在载玻片上（注意避免气泡的产生）。

13、观察：将制备好的标本置于光镜下，在高倍镜下可见许多呈阳性反应的巨噬细胞，其细胞质中出现许多大小不等的棕色或棕黑色颗粒和斑块，这便是酸性磷酸酶存在的部位（溶酶体），有些细胞内酸性磷酸酶极为丰富，故整个细胞质都呈现出黑色沉淀。

【 作业与思考 】

1、简述酸性磷酸酶显示原理。

2、绘制3~4个巨噬细胞图，分别表示酸性磷酸酶存在部位。