肠杆菌（谷氨酸脱羧酶）酶粉的制备
[适用对象] 生物工程专业
[实验学时] 4学时
一、实验目的
掌握大肠杆菌谷氨酸脱羧酶酶粉的制备方法，为谷氨酸的测定准备原料。
二、实验原理
谷氨酸脱羧酶是目前测定谷氨酸所必需的工具酶，酶法测定具有专一性高，反应灵敏等特点，较少受其它因素的干扰。
三、仪器设备
恒温培养箱、高压灭菌锅、恒温摇床、水环式真空泵、冰箱、干燥器
四、相关知识点
大肠杆菌谷氨酸脱羧酶酶粉，为谷氨酸测定的原料，因此其活性决定了形成谷氨酸量。
五、实验步骤
（一）菌种的培养
先将菌种E. coli -TS在传代培养基上培养24小时。
传代培养基配方：牛肉膏 1.0％ 蛋白胨 1.0％ NaCl 0.5% 琼脂：1.7％;
用50% 氨水调pH至7.2， 0.1MPa灭菌30分钟，摆成斜面。
底层平板培养基：葡萄糖0.1％ 蛋白胨1％ 牛肉膏1.0％
氯化钠0.5％ 琼脂2.0～2.5％； pH：7.0.
上层平板培养基：葡萄糖0.1％ 蛋白胨1％ 牛肉膏1.0％
氯化钠0.5％； 琼脂 0.7％； pH：7.0.
上、下层培养基分装二个三角瓶，纱布牛皮纸封口后，0.1 MPa灭菌30分钟。
（二）一级种子培养
培养基配方： 牛肉膏 5.0％ 蛋白胨 4.0％
磷酸二氢钾 0.25％ （分消）； 用50% 氨水调pH至7.1
（三）发酵培养基
牛肉膏：2.0％ 蛋白胨：1.5％ 葡萄糖：0.1％
玉米浆粉： 0.1％ 磷酸二氢钾：0.25％（分消）
用50% 氨水调pH至7.1
装量：1000毫升三角瓶装200毫升 灭菌：0.1MPa，20分钟。冷却后接种，接种量5％，接种后在36℃摇床上培养。摇床转速：往复式为97转/分，旋转式为170转/分。
（四）收集菌体
将摇瓶中的发酵液收集后，用冷冻离心机离心，收集菌体。菌体用蒸馏水洗二次。
（五）制备冷冻干粉
将菌体用少量蒸馏水制成菌悬液，加入10倍体积的冷冻丙酮（－18℃），搅拌均匀，真空抽滤，将滤下的菌体再用5倍冷冻丙酮搅拌均匀，真空抽滤。将菌体加入5倍体积的冷冻乙醚（－18℃）脱水，抽滤后将菌粉放在干燥器内，放入冰箱二天，二天后将菌粉过筛，测定酶活性
六、实验报告要求
实验报告书写统一格式，实验全部完成后，统一交阅，且要求写实验心得。
七、思考题
影响谷氨酸脱羧酶活性的因素有哪些？
八、实验成绩评定办法
主要评分点：原理描述、实验流程、数据记录、解决问题的能力、实验结果、等。平时和实验报告各占1/2。
