目的要求:
掌握还原糖和总糖的测定原理,学习用比色法测定还原糖的方法。
实验原理:
在NaOH和丙三醇存在下,3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色,在540nm波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值呈线性关系,利用比色法可测定样品中的含糖量。
试剂和器材
一、试剂
3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入1000ml容量瓶中,加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml,再加入45g丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000ml。
葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至100ml,即含葡萄糖为2.0mg/ml。
6mol/L HCl:取250ml浓HCl(35%~38%)用蒸馏水稀释到500ml。
碘-碘化钾溶液:称取5g碘,10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
6N NaOH:称取120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。
0.1% 酚酞指示剂。
二、材料
藕粉,玉米淀粉。
三、器材
WFJ UV-2000型分光光度计,水浴锅,电炉,15mm×180mm试管。
操作方法
一、葡萄糖标准曲线制作
取5支15mm×180mm试管,按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。
|
管号 |
|
葡萄糖标准液 |
蒸馏水 |
葡萄糖含量 |
OD540 |
|
|
|
/ml |
/ml |
/mg |
|
|
0 1 |
|
0 0.2 |
1 0.8 |
0 0.4 |
|
|
2 |
|
0.4 |
0.6 |
0.8 |
|
|
3 |
|
0.6 |
0.4 |
1.2 |
|
|
4 |
|
0.8 |
0.2 |
1.6 |
|
|
5 |
|
1 |
0 |
2 |
|
在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml,于沸水浴中加热2min进行显色,取出后用流动水迅速冷却,各加入蒸馏水9.0ml,摇匀,在540nm波长处测定光吸收值。以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖含量(mg)为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。
二、样品中还原糖的提取
准确称取 0.5g藕粉,放在100ml烧杯中,先以少量蒸馏水(约2 ml)调成糊状,然后加入40ml蒸馏水,混匀,于50℃ 恒温水浴中保温20min,不时搅拌,使还原糖浸出混。过滤,将滤液全部收集在50ml的容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,即为还原糖提取液。
三、样品总糖的水解及提取
准确称取0.5g玉米淀粉,放在锥形瓶中,加入6mol/L HCl 10ml,蒸馏水15ml,在沸水浴中加热0.5h,取出1~2滴置于白瓷板上,加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。水解毕,冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂,以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色,并定容到100ml,过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中,定容至刻度,混匀,即为稀释1000倍的总糖水解液,用于总糖测定。
四、样品中含糖量的测定
取7支15mm×180mm试管,分别按下表加入试剂:
项目 |
空白 |
|
还原糖 |
|
|
总糖 |
|
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
样品溶液/ml |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
3,5-二硝基水杨酸试剂/ml |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
加完试剂后,于沸水浴中加热2min进行显色,取出后用流动水迅速冷却,各加入蒸馏水9.0ml,摇匀,在540nm波长处测定光吸收值。测定后,取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。
五、结果处理 按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量:
式中:C──还原糖或总糖提取液的浓度,mg/ml;
V──还原糖或总糖提取液的总体积,ml;
m──样品重量,g;
1000──mg换算成g的系数。
注意事项
标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行,一起显色和比色
思考题
1. 比色时为什么要设计空白管?
2. 比较费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果,这两种方法各有何优点?