酶联荧光RFLP技术标准

1 全血或冻溶血抽提DNA

1.1 全血溶解

注：1）细胞溶解液（cell Lysis Buffer）和蛋白酶K（pro-k）在使用时，置放在冰盆内。

2）蛋白溶解液（Protein Lysis Buffer）应放在室温。

3）操作中全部试剂的用量是依据0.5ml血液样本而设定的，应精确保用各试剂用量。

①移取0.5ml全血，加入标记5ml管。

②加1.8ml细胞溶解液到各试验管，加盖，倒转数次使其混匀，置于冰盆内待到全部试验样本操作完备后，准备离心。

③在水平台式离心机上离心，1250rpm，离心时间5min，注意在离心前一定要配平。

④从离心机取出样本，仔细地倒去上清液，用新华滤纸吸取残剩上清液。注意，不要将离心沉淀物（pellet）丢掉。假若沉淀物被悬浮，就将样本管垂直放置，小心吸弃上清液。

⑤在旋涡混合器上，用残存上清液悬浮沉淀团。

⑥每样本管加2ml细胞溶解液，加盖，在旋涡混合器上，混匀沉淀团，重复第3-4步骤。

⑦再在旋涡混合器上，混匀样本。

⑧在第6步骤离心时，按下列配方准备蛋白酶混合液。

⑨每样本管加蛋白酶混合液250μl，加盖，轻轻地倒转数次，禁止剧烈振荡。⑩将全部样本管放入恒温水浴摇床内，37±1℃培养2hrs，中速摇动。

⑾每管加50μl高氯酸钠（Sodium Porchlorate）加盖，轻轻地倒转数次，进入抽取步骤。

1.2 DNA抽取

注：1）抽提溶液I，II，III都是剧毒试验，应带乳胶手套、口罩，在通风处操作。

2）用前，全部抽提溶液复温。

3）对于上述全部样本管按下列步骤进行操作。

①每样本管加等体积抽提溶液（约0.5ml），加盖扣紧，在室温倒转使之混合。

②将全部样本管配平后，放置在水平离心机内2000rpm，离心7min。

③Phenol相（淡黄色的有色相）在样本管液体的上层，吸弃Phenol相，继续进入第5步骤，假若Phenol相在样本管底部，液相（无色相）在上层，吸移上层液相和带有白色的界面层到新的管内，丢去Phenol相。

④每样本加等体积抽提溶液II（约65ml）加盖扣紧，在室温倒转使之混匀。

⑤离心2000rpm，离心时间7min，吸移上层相和界面到新管内。

⑥每管加等体积抽提溶液Ⅲ，加盖扣紧，倒转混合。

⑦离心2000rpm，时间7min，离心后小心从离心机内取出样本管，吸取上清部分，准备透析。

2 透析DNA

2.1 准备透析用具，试验器械、透析管、透析夹、透析液、容器、磁力搅拌机。

2.2 配制透析液1：100透析贮存液，配制2000ml。

2.3 准备透析管：将透析管剪成5cm长，一端用已标记透析夹封住，浸泡在透析液过夜备用。

2.4 将透析管从透析液中取出，用滤纸吸去残留透析液，吸移样本管上层相，放入透析管内，避免吸取界面，用透析夹封住另一端，放回透析液中，注意，认真验对透析夹与样本编号相对应，并记录。

2.5 样本透析在4℃冰箱中进行，磁力搅拌机搅动透析样本，每4h换一次透析液，共3次。

2.6 已经透析的大分子DNA在室温是稳定的，在4℃可以短期保存抽提DNA，若需要长期保存，应贮存在乙醇中，若者是在0.3M Ammonium Acetate。禁止冷冻大分子DNA。

3 DNA定量

3.1 制备0.8% Agarose凝胶

Agrose 1.2g

1×TAE Buffer 150ml

加到300ml三角烧瓶摇匀，放置微波炉中 2min，移出，用力水平摇匀，再放置微波炉 20秒，待冷至 65℃后，加 10μlEB·(mg/ml)，将150μl溶解胶，倾入水平的制胶板框内，在一端插入17孔的梳子，在室温使凝胶固化45分钟备用，将已制好凝胶板浸入电泳槽缓冲液中，注入1×TAE缓冲液2000ml，缓冲液面有胶面上1cm为宜。

3.2 在65℃的干热器上，将DNA定量标准30NG、20ng、10ng、5ng、1ng和DNA可视性大小标准，放置在干热器上5min，离心。

3.3 吸取样管DNA 2μl（吸前注意将样本混匀）与8μl×loading Buffer在微量反应板上混匀，备用。

3.4 加样，依次从右向左加DNA定量标准和样本：

3.5 电泳条件：输出端电压90V（或经过混胶两端电压调至50V），万用表检测其直流电压，电泳时间1hr，关闭电源。在电泳时，需要观察电压，电流，以确保电泳在进行，简便的方法是观察两侧电极是否有电解气泡连续上浮，示运转正常，也可观察溴酚兰向阳极进行性迁移。

3.6 电泳结束后，将凝胶板从电泳槽取出，放置紫外分析仪上，观察结果，并用一次成像记录结果，F5.6，曝光1/2秒，显像60秒。

3.7 比对记录样本DNA含量。台Yield Gel 5.1a,5.1b,5.1c,5.1d所示。

4 HaeⅢ限制酶消化样本DNA

注意：1）HaeⅢ限制酶在使用前从冰箱取出，放置冰上，用后立即冷冻保存-20℃。

2）阳性对照和样本从第一步开始。

3）在使用前，立即准备，限制酶反应液，放置冰上备用。

4.1 根据DNA定量结果，决定每个样本需要的μl数。每个样本取4μg DNA，就足以满足遗传信息、亲权鉴定、个体识别的RFLP三次分析。因此，每个样本以4μg DNA计算，来推算所要样本的μl数，体积加dH2调到200μl。

阳性对照的DNA浓度为100 ng/μl，即取阳性对照40μl，dH2O。

4.2 按每份样本所需限制性酶反应液200μl，配制内切酶混合，充分混匀备用，按下列比例配制。

4.3 每管加200μl限制性酶反应液，在旋涡混合器上简捷地混匀，在微型离心机上200xg,2min使内容沉降管底部。

4.4 在37℃±1培育2hrs，在离心机上2000xg,2min。操作到此步骤时，可暂 时停止实验，样本-20℃贮存。

4.5 每管加200μl平衡盐，在旋涡混合器振荡5sec，静置在冰上10min或者放置冰箱冰格内10min。

4.6 在微型离心机上10000rpm离心10min，以沉淀蛋白质。移取上清液到新标记的1.5ml管内，因为，沉淀物用肉眼难以分辨，在操作时，避免吸收管底沉淀的蛋白质和其它沉淀物。

4.7 在室温，给每管加95% Ethanol 1.0ml，倒转充分混合，室温静置20～30min。

4.8 在微型离心机上13000rpm离心20min，弃去上清液，用滑低吸附残留上清液。

4.9 每管70% Ethanol 1.0ml，倒转，充分混合。

4.10 沉淀DNA在微型高速离心机上离心13000rpm 100,20min。仔细吸弃上清液。注意：沉淀团（DNA）与管壁附着的不牢固，避免粗心将沉淀团弃去。滤纸吸去残留上清液。

4.11 干燥沉淀DNA，放置在抽风的超静台内，空气干燥2～3hrs。有条件时，可在真空干燥器内，干燥5～10min。到此步骤可以暂停止实验，样本DNA放置-20℃。

4.12 每管加40μl无核酶酸dH2O,在65℃培育5min，旋涡振荡器上，充分混合。再放置65℃培育5mins。

4.13 放在旋涡振荡器完全悬浮DNA，把样本管微型离心机上简捷离心，使内容物沉于管底部，操作到此步骤时，样本DNA可放置-20℃贮存。

5 检测酶切DNA片段与再消化DNA

5.1 检测酶切DNA片段

5.1.1 制备0.8% Test Gel，取：

Agarose 1.2g

Gel Buffer 150ml

在三角烧瓶混匀，放置微炉中2min，取出用力顺时针摇动，使沉地瓶底的Agarose悬浮，再微波炉里，20Sec，充分溶化，观察瓶的液体的琼脂糖，凝胶为无色、透明、均匀液体，待温度降至55℃时，加入10μl溴化乙锭，混合，将液体琼脂糖注入制胶模框内，插入梳子，室内固化30mins备用，注意：带手套、避免手接触EB。

5.1.2 取0.8%凝胶板，放置电泳槽内，注入1×Ggel Buffer，使液体面在胶上1cm为宜。

5.1.3 制备样本，每管取5μl酶切DNA样本，加入μl 2×Loading Buffer混合于1.5ml管内。

5.1.4 培育全部待测样本，可视性大小标记和Hae Ⅲ TestGel质控对照，放置65℃ 5min。

5.1.5 在旋涡荡器上混合，简捷离心，沉降内容物。

5.1.6 加样，依次加入可视性大小标记，Hae Ⅲ TestGel质控对照和样本DNA。

5.1.7 电泳，端电压90V，经过Gel，电压50V，电泳时间1hr，随时注意观察电泳现象。

5.1.8 电泳结束后，把胶板放置紫外分析仪上，观察桔黄荧光的电泳谱带，用一次成像照像记录结果。如图Test Gel 5.2A,5.2B,5.2c所示。

5.1.9 结果分析，比较待测样本DNA的电泳谱带与Hae Ⅲ TestGel质控对照电泳谱带的迁移率和荧光强弱。Hae Ⅲ TestGel荧光亮度相当于500ng的DNA，在5μl的样本中，也应含有大约500ng DNA，才能适合Analytical Gel的用量。

5.1.10 假若样本DNA荧光强度不如Hae Ⅲ TestGel质控对照，应再取4μg DNA样本重新消化。假若样本DNA荧光强度超过Hae Ⅲ TestGel（500mg），应对样本用dH2O进行稀释。

5.1.11 分析后，酶切DNA样本量（500ng），消化程度与Hae Ⅲ TestGel相同，即可进行Analyticd Gel电泳。

5.2 再消化样本DNA

5.2.1 在Test Gel电泳分析后，认为样本DNA消化不良，应进行再次消化。

5.2.2 每管加5μlHae Ⅲ Buffer和4μlHae Ⅲ 酶，在旋涡荡器上混匀，简捷离心。

5.2.3 在37℃恒温浴摇床上，摇动、培育2hrs。

5.2.4 在65℃热处理5min，简捷离心，使内容物沉于管底。

5.2.5 假若，在Test Gel电泳分析后，仍有样本消化不良，将样本弃去，重新取全血样本提取DNA。

5.3 分析凝胶电泳

5.3.1 样本准备：将样本DNA从冰箱移取解冻，加入40μl 2×Loading Buffer混匀。

5.3.2 将全部待测样本，等位基因对照，分子量大小标准和联合对照简捷离心，使内容物出现于管底。

5.3.3 在65℃干加热培育10min，简要离心，备用。

5.3.4 10% Analytical Gel制备

Agarose 1.5g

Gel Brffer 150ml

在微波炉加热溶化后，制成Analytical Gel。具体操作参照Test Gel制备法。

5.3.5 加样：人类基因分型时，按下列次序以次加样，右起第一孔Idenfity Combination Standard第17孔加Identity Sizing Standard,各10μl，2～16孔加样本DNA 20μl。

假若亲子鉴定，按下列次序加样

5.3.6 电泳条件：凝胶两端电压19V，电泳20hrs。在电泳结束前1hrs，在电泳槽里加入200μlEB，其中阳极加入100μlEB，阴极加100μlEB。

5.3.7 结束电泳，在UV灯下照相记录Analytical Gel电泳结果，假若可视性标准的第四条（1.01kb）电泳谱带，距加样孔12cm，表示电泳已经完成。假若达不到，继续电泳。如analytical Gel 5.3a,5.3b所示。

5.4 Southern转印DNA到尼龙膜

5.4.1 配制转印溶液

5.4.2 将Analytical Gel浸入500ml变性溶液里，室温在摇床缓慢摆动30min。注意不要超过30min。

5.4.3 准备尼龙膜用HB2#铅笔在尼龙膜右上角标记，案例编号，日期和使用探针。

5.4.4 取2L变性溶液注入变性槽内，用3M滤纸浸变性溶液后搭桥。

5.4.5 仔细将变性处理的Analytical Gel面向下，铺在桥纸上，排掉气泡。

5.4.6 将标记好的尼龙膜贴有Analytical Gel上面，标记面向上，排掉气泡。

5.4.7 用Parafilm把Analytical Gel四边封好，确保Analytical Gel仅接触上转印的滤纸。

5.4.8 放置2张用2×SSC浸泡的blotting paper，在尼龙膜上，排掉气泡。

5.4.9 放置3张干的blotting paper在湿的blotting paper之上。

5.4.10 放置5cm厚的新华滤纸在干blothing paper之上。

5.4.11 在最上面加有机玻璃平板和500g重物。

5.4.12 在室温转移应大于6hrs或者过夜。

5.5 固定限制性DNA片段

5.5.1 转印结束后，取出尼龙膜。

5.5.2 准备500ml 2×SSC，戴上手套，用手洗去尼龙膜残留胶块。

5.5.3 将尼龙膜在室温自然凉干10min。

5.5.4 将尼龙膜放置80℃杂交箱内30min，烤干。

5.5.5 将尼龙膜放置在UV-CrosseLinker-2400自动交联仪上，12000×100uj/cm2，进行自动交联两次。

5.5.6 进入杂交步骤，或者装在塑料袋内贮存，备用。

5.5 单位点探针与转印膜杂交

5.5.1 配制下列试剂：

Wash Ⅰ和Wash Ⅱ在室温可贮存一周。

5.5.2 将Lumi-Phose 480放置室温，使用前将Wash Ⅰ，Wash Ⅱ和杂交液（不含探针）在55℃水浴90min。

5.5.3 每张尼龙膜取Wash Ⅱ 30ml，装在盘内，在室温振荡5～10min。

5.5.4 在操作第3步时，每张尼龙膜10ml杂交液和10μl Nice Probe混合，使用前在55℃培育10mins。

5.5.5 倒弃Wash Ⅱ，将预热的Nice probe和杂交液装在塑料袋内杂交55℃ 20～25min。注意：在55℃培育不要超过30min，结是的背景将会加深。

5.5.6 倒掉杂交液，将尼龙膜放置洗盘内，每张膜加Wash Ⅰ 100ml，在55℃水浴振荡至少5min。

5.5.7 倒掉Wash Ⅰ，加每张膜Wash Ⅱ 100ml，在55℃水浴振荡至少5min，倒掉Wash Ⅱ。

5.5.8 1×QLB 200ml，室温轻轻漂洗3次，使尼龙膜浸入剩余的1×QLB 中。

5.6 荧光素自显影。

5.6.1 将尼龙膜铺在塑料袋夹上，用喷雾器向膜面均匀喷LumiPhose 480，将塑料夹两面贴上，排除气泡和多余的LumiPhose 480。

5.6.2 用热合机将塑料袋四边热封，确保Lumi-phose 480不会漏出。

5.6.3 将封好的尼龙膜袋放置在X光片夹里，以下进入暗房操作。将X光片贴于尼龙膜表面，合上暗盒，在37℃曝光2hrs，或者室温过夜。假若背景和主要带太暗，应缩短曝光时间。

5.6.4 数字化仪分析结果

将全部样本的RFLP图谱的汉族群体遗传学信息，经过数字化扫描分析仪，输入计算机。

把已获得的图谱信息，转变成等位基因片段长度的bp数据，列出等位基因，基因频率，杂合性测量，Hard-Weinbery平衡吻合度检验，建立本地区群体的基础数据库。

5.7 剥脱杂交探针与再杂交

5.7.1 预热Wash Ⅰ 65℃±1℃。

5.7.2 每张膜加入100ml Wash Ⅰ。

5.7.3 在恒温水浴摇床上，轻轻摇动30min，浴温65℃±1℃。

5.7.4 倒掉Wash Ⅰ，进入杂交的操作步骤。

5.7.5 尼龙膜剥脱后，也可空气干燥室温贮存。