溶菌酶的制备及其性质

溶菌酶的制备及其性质

【实验目的】

同羧肽酶实验

【实验要求】

同羧肽酶实验

【实验内容】

1.溶菌酶Y活性检测

⑴ 酶活力测定方法

⑵ 酶活力单位定义

⑶ 比活力定义

⑷ 蛋白含量测定方法

2. 蛋清溶菌酶的提取

⑴ 每组4～5个新鲜鸡蛋

⑵ 利用等电点沉淀及树脂层析等方法进行溶菌酶提取

3. 溶菌酶的分离、纯化

⑴ 利用各种方法，从上述提取液分离

⑵ 每步纯化前蛋白纯度检测

⑶ 分离纯化过程中跟踪检测活性组份的蛋白质含量和酶活性

4. 溶菌酶理化性质

⑴ 溶菌酶的分子量测定

⑵ 溶菌酶的等电点测定

5. 溶菌酶的酶学性质

⑴ 在活力单位定义确定后，求出溶菌酶的Vmax和Km

⑵ 初步确定溶菌酶的最适pH

⑶ 初步确定溶菌酶的最适温度

⑷ 提出最少两种溶菌酶的可逆抑制剂并验证抑制类型

⑸ 提出溶菌酶的激活性并验证

(6) 溶菌酶的热稳定性

【实验原理】

溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。在280nm的消光系数[ ]为13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。

　　溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。

溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性 ，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE鉴定为一条带。采用福林酚法测蛋白含量，分光光度法测定酶活性。

【实验材料】

1.实验器材

循环水式真空泵 HSB-IⅡ; 蛋白紫外检测仪; 记录仪; 紫外分光光度计; 梯度混合器(500mL); 721型光分光光度计; 冰冻离心机；冰箱；透析袋；酸度计；部分收集器；恒流泵；圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析柱(2.6×50cm)(1.6×30cm)；布氏漏斗(500mL)；吸滤瓶(1000mL)；G-3砂芯漏斗(500mL)

2．实验试剂

⑴ 鸡蛋清（鲜鸡蛋）

⑵ 底物微球菌粉

⑶ D152大孔弱酸性阳离子交换树脂

⑷ 固体氯化钠（NaCl）；固体硫酸铵(NH4)2SO4；固体磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）；固体磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）；固体磷酸钠（Na3PO4）

⑸ 乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮

(6) 溶菌酶标准品；Sephadex G50

⑺ N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸

⑻ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂（见实验六）；蛋白含量测定（福林法）试剂（见实验二）

⑼ 聚乙二醇-20000、两性电解质

【实验操作】

1.蛋清的制备

将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml.

2.鸡蛋清粗分离

按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。

3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析

⑴ D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/L NaOH搅拌浸泡并搅拌4～8小时，抽滤干NaOH, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCl , 用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.5 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。

⑵ 装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～20cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH6.5, 0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。

⑶ 上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1ml/min。

⑷ 洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/L NaCl的pH值6.5，浓度为0.02 mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液。

⑸ 聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。

(6) 透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。

4.Sephadex G50分子筛柱层析

⑴ 装柱：先将用20%乙醇保存的Sephadex G50抽滤除去乙醇，用6g/LNaCl溶液搅拌Sephadex G50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为此。(如果Sephadex G50是新的，则按实验五中的方法处理凝胶)。加入胶体积1/4的6g/L NaCl溶液，充分搅拌，超声除去气泡，装入玻璃层析柱（1.6×50cm），柱床45cm。

⑵ 上样：与实验五中的方法相同。

⑶ 洗脱:样品流完后，先分次加入少量6g/L NaCl洗脱液洗下柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为0.5mL/min，用部分收集器收集，每10分钟一管。

⑷ 聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。

⑸ 透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。收集透析液，量取体积。

5. 溶菌酶活力测定

⑴ 酶液配制：准确称取溶菌酶样品5mg, 用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50µg/ml.

⑵ 底物配制：取干菌粉5mg加上述缓冲液少许，在乳钵中（或匀浆器中）研磨2分钟，倾出，稀释到15～25ml，此时在光电比色上的吸光度最好在0.5～0.7范围内。

5.3 活力测定：先将酶和底物分别放入25 OC恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后吸取样品液0.2mL（相当于10µg酶），每隔30s读1次吸光度，到90s时共计下四个读数。

活力单位的定义是：在25℃，pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1个活力单位。

酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001

比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质

6. 蛋白质含量的测定

采用Folin-酚试剂法进行测定。（参见实验二）

7. 纯度检测

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。（参见实验六）

8. 理化和酶学性质的测定

学生可根据酶纯化和活力测定的结果，运用已掌握的生化知识和实验技能自行设计方案进行探索研究。

【实验结果】

【思考题】

1．请说出其它提取和纯化溶菌酶的方法吗？请写出相关的方法及原理。

2．根据自身的实验体会，写出优化本实验的措施。