纳豆激酶( nattokinase , NK）是日本学者须见洋行于1987 年从日本传统食品—— 纳豆中发现的一种具有高效溶血栓活性的酶。研究表明，NK是纳豆枯草杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，不但能直接作用于纤维蛋白，而且还可激活体内的纤溶酶原，从而表现出很强的溶血栓作用。此外，NK 还具有作用半衰期长、无毒副作用、成本低、可以口服等优点，是一种极有开发前景，有望成为继尿激酶、链激酶、tPA 后的新一代溶栓剂。该酶的分子量为28000 -30000，最适作用温度为37 ℃ ，最适作用pH 值为7 . 4 。MgZ 十、ca “千是该酶较好的稳定剂和促进剂，而ZnZ 十、Al “半、CuZ 十为其抑制剂。
目前，采用固体或液体发酵培养微生物，使其产生纳豆激酶，然后再从发酵产物中以常规提取纯化的方法制备纳豆激酶。各种制备方法的差异主要集中在使用的纳豆原材料方面，现分别介绍如下
实例 238 豆豉纤溶酶制备
纳豆激酶分布于发酵液中，过滤除去菌体，以硫酸铁盐析获得粗品酶，再以离子交换树脂、分子筛进行纯化，最后进行真空干燥，获得纯化纳豆激酶。
( l ）工艺流程
( 2 ）主要步骤
① 种子培养基称取2 . 0 份麦芽糖、2 . 0 份果糖、1 . 5 份大豆陈、o , 2 份酵母浸膏、0 . 1 份KH 。PO4 、0 . 3 份KZHPO ；、0 . 05 份MgSO 。• SHZO 、0 . 02 份CaC12 • ZHZO ，然后用去离子水补充至100份。配制成pH 值为7 ．0的种子培养基
将制备好的种子培养基进行高压灭菌，灭菌温度为121 ℃ ，时间为20- 30min 。灭菌后待培养基冷却至30 ℃ 时，在无菌条件下接种培养基体积2 ％的菌抱子悬液，混合均匀后置于旋转式摇床上，在振幅为25mm 、转速为27Or / min 、30 ℃ 振荡培养18h ，获得一级种子。
② 发酵培养基称取2 ．0份麦芽糖、2 . 0 份果糖、30 . 0 份大豆浆、0 . 2 份酵母浸膏、0 . 1 份KHZPO ，、0 . 3 份KZHPO ；、0 . 05 份MgS 认，SHZO 、0 . 02 份CaCI ，• ZH : O ，用去离子水补充至100份，获得发酵培养基，其pH 值为7 ．0
③ 发酵 在容积为81 的LF2G5A 型自控发酵罐中加入5L 发酵培养基，进行自动定温灭菌。灭均温度及时间同种子培养基高压灭菌。然后在无菌条件下顺序将种子培养液和经高压灭菌的甘油聚醚消泡剂加入，种子培养液用量为发酵培养基体积的2 % ，消泡剂用量则为0．1 % （体积分数）。控制发酵温度为（30 士0.2 ）℃ ，pH 值为7 . 0 ，搅拌转速为8O0r / m 动，通入无油三级过滤空气，通气量为1 倍发酵液体积／min ，发酵时间为76h 。
④ 除杂蛋白 发酵完成后放罐，将发酵液进行离心分离，离心机速度为5000r / min ，时间为20min 。收集上层清液，置于盐析罐中，控制上清液温度低于10 ℃ ，在搅拌下加入硫酸钱，直至饱和度达到25 ％时停止搅拌，静置直至杂蛋白沉淀析出。5000r / min 离心20min ，除去杂蛋白沉淀。
⑤ 盐析、超滤 收集离心上层清液，再次控制其温度低于10 ℃ ，在搅拌下加入硫酸按，直至饱和度达到60％时停止搅拌，然后在同温度下静置过夜。次日虹吸弃上清液，下层浊液进行离心分离，离心机速度为5000r / min ，离心时间20min 。收集沉淀，用少量去离子水溶解后进行超滤除盐，获得豆豉纤溶酶粗品。测定其酶活力，备用。
⑥ 纯化 根据Sephadex G2100 的容量及豆豉纤溶酶粗品的酶活力计算出所需树脂量，称取定量树脂，用去离子水进行溶胀处理。将溶胀2 天的Sephadex G2100 装入色谱柱，用0 . lmol / L 磷酸缓冲液（PBS）-0 . 2mol /L NaCI( pH7.4）缓冲液进行平衡。然后，将粗酶液小心加入柱中，以相同缓冲液进行脱洗，用分部收集器收集有纤溶活性的组分，即为精制豆豉纤溶酶。
此外，还可以用CM -SepharoseFF 离子交换色谱、Superdex75 凝胶色谱等进行精制。用SePhacryls2200 柱色谱纯化豆豉纤溶酶的主要步骤为：将Sephacryls2200 树脂装柱，用0 . lmol / L PBS、0.5mol/ LNaCI 缓冲液（pH 值7 . 4 ）进行平衡，然后上样，并以相同缓冲液洗脱。分部收集呈单一对称峰的活性组分，用蒸馏水透析过夜及冷冻干燥，获得白色粉末豆豉纤溶酶。
( 3 ）主要指标
经Sephadex G2100 色谱纯化的豆豉纤溶酶：纯化28 倍，收得率为51 % ；经Sephacryls2200 色谱纯化的豆豉纤溶酶：纯化44 倍，收得率为68 ％。获得的豆豉纤溶酶平均分子量为31000 , PI 为8 . 6 士0．2 ，豆豉纤溶酶在40 ℃ 以下稳定性良好，50 ℃ 放置lh 则严重失活，60 ℃ 活性全部丧失。该酶在pH 值为7 - 11 稳定，而在pH 值低于5 时很快失活。
实例239 固体发酵制备纳豆激酶
用固态法发酵纳豆，是传统的制备豆豉方法，虽然原料利用率较低，但是发酵条件较简单，实用性较强。
( l ）工艺流程
( 2 ）主要步骤
① 分离枯草芽孢杆菌菌种 枯草芽孢杆菌菌株：从25 批市售豆豉中筛选出形态良好的10 株枯草芽孢杆菌，经发酵实验，获得1 株产纤溶活性蛋白酶最高的菌株，批号为031201 。
② 制备平板分离培养基 取2 份酵母粉、0．4 份麦芽糖、0．7 份NaHZPO 。、0 . 5 份NaCI 、2 份琼脂粉，用去离子水稀释成100 份。置于高压锅中，在121 ℃ 灭菌30min 后冷却至常温，然后在无菌条件下接入豆豉浸出溶液，37 ℃ 培养24h ，获得1 株产纤溶活性蛋白酶最高的菌株，批号为031201 。
③ 扩大培养 配制试管斜面培养基。取1 份蛋白脉、0．5 份NaCI 、0．1 份KZ HPO ；、2 份琼脂粉、50份肉汤，用去离子水稀释成100 份。置于高压锅中，在121 ℃ 灭菌30min 后冷却至常温，然后在无菌条件下接入批号为031201 的菌株，于37 ℃ 培养24h ，获得扩大培养菌种。
④ 生产菌种培养 配制三级扩大种子。取0.3 份NaZ HP 认、0 . 03 份KHZPO 。、0 . 05 份MgSO 。、0 . 5 份麦芽糖、2 . 0 份酵母粉，置于锥形瓶中，在高压锅中于121 ℃ 灭菌30min 后冷却至常温，然后在无菌条件下接入扩大培养菌种，于37 ℃ 、200r / min 转速下培养6h ，获得液体生产菌种。
⑤ 接种 称取定量黄豆，洗净后浸泡过夜，次日捞出，置于甑子中蒸煮50min （以甑子下水温度达到沸腾时计）。然后取出，置于接种锅中，待其温度降低至35-40 ℃ 时，加入培养好的种子液，进行搅拌，接种量的体积（mL ）为黄豆质量（g ）的10 ％。最后，将接种完成的黄豆置于木质或竹质等浅盘中进行发酵，发酵物料的厚度为10 - 15cm 。
⑥ 发酵在发酵室中，将盛有发酵物料的浅盘置于发酵架上，控制温度为37 ℃ ，发酵时间为24h ，获得富含纳豆激酶的豆豉。
( 3 ）主要指标
发酵豆豉中纳豆激酶活力为193lIU / g 。
制备纳豆激酶必须先行发酵，液体发酵养分利用率高，纳豆激酶溶解于发酵液中，容易分离，因此更适合于大规模生产。
( 1 ）制备纳豆激酶液体发酵液的工艺流程
( 2 ）主要步骤
① 分离纳豆芽抱杆菌菌种首先配制平板分离培养基（BPY 培养基）。取0 . 5 份葡萄糖、0 . 5 份牛肉膏、1 份蛋白脉、0 . 5 份酵母膏、0.5 份NaCI 、2 份琼脂，用去离子水溶解并定容至100份，pH 值为7 ．0，获得平板分离培养基。将该培养基置于高压灭菌锅中，于121 ℃ 处理20 - 30min 。泄压后将培养基冷却至30-37 ℃ 时，在无菌条件下进行接种，然后于37 ℃ 培养9 - 12h ，获得纳豆芽抱杆菌6 号菌株。
② 扩大培养 接着配制试管斜面培养基。取2 份葡萄糖、1 份蛋白陈、0 . 1 份KZHPO 。、0.05份MgSO4 、2 份琼脂，用20 份土豆十10 份豆芽混合后煮汁，纱布过滤后溶解上述养分，定容至100 份。将该培养基置于高压灭菌锅中，于121 ℃ 处理20 ～30min 。泄压后将培养基冷却至30 ～ 37 ℃ 时，在无菌条件下进行接种，然后于37 ℃ 培养9 ～12h ，获得扩大培养菌种。
③ 发酵培养 最后配制液体发酵培养基。取2 份葡萄糖、l 份蛋白胨、0．1 份KZ HPO ；、0 . 05 份MgSO ；、2 份甘油、20 份豆饼酶水解液，用去离子水溶解并定容至100 份。将配制好的液体培养基置于发酵罐中，进行在线灭菌，灭菌温度及时间分别为121 ℃ 和20 ～ 30min 。
将灭菌培养基降低温度至37 ℃ ，在无菌条件下接入扩大培养菌种，接种量为2 ％～5 % （体积分数）。接种完成后，控制发酵温度为37 ℃ 、pH 值为6 ～8 、摇床振荡频率为2 00r / min 、通气培养16h ，获得纳豆发酵液。
( 3 ）主要指标
发酵液产酶量为160～200IU / mL 。
实例241 超滤法制备纳豆激酶
李立民等将纳豆发酵液进行预处理，降低黏度及杂质，用超滤器进行浓缩，除去部分小分子杂蛋白、色素及无机盐，用离子交换树脂进行交换，进一步除去杂蛋白，最后进行冷冻干燥，获得纯度较高的纳豆激酶。
( 1 ）工艺流程
( 2 ）主要步骤
① 预处理取定量纳豆发酵液，置于沉淀罐中，在搅拌下缓慢加入浓度为20 % ( 200g / L ）的CaCI ：溶液，CaC12 溶液用量约为发酵液体积的0 . 5 %。然后，3000 ～ 5000r / min 离心10 ～ 20min ，收集上层液用浓度为30 % ( 300g / L ) 碳酸钠 ：调节pH 值为7 . 5 ，再次离心，收集上层清液备用。通过该处理，蛋白质回收率为65 . 2 % ，降低34.8%；酶活力收得率为90.7% ，降低10.3%。
② 超滤浓缩将收集的离心上层清液进行冷却，使温度降低至4 ℃ ，然后泵入超滤机，用截留分子量1 0000 的超滤膜进行超滤浓缩，在浓缩过程中不断加蒸馏水以降低离子强度。待浓缩液电导率约为800 μS / cm 时停止超滤，此时浓缩倍数约为10 倍。通过超滤，酶活力回收率为89 . 34 % ，仅损失1 . 5 % ，而蛋白质回收率为57 % ，降低7 . 2 ％。
③ 色谱精制将超滤浓缩液上CM-52 柱，控制流出速度为50mL / min ，先用浓度为0.005mol / L 、pH 值为8.0的磷酸缓冲液洗脱至基线后，接着用浓度为0.02mol / L 、pH 值为10 的磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰进行冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉。冷冻干燥条件为：温度-60 ～-50 ℃ ，真空度为25～50Pa ，时间为24h 。通过该处理，蛋白质损失率达80 . 2 % ，酶活力损失26 . 46 ％。若要获得比活力更高的纳豆激酶制品，可以将洗脱液进行分子筛色谱后进行冻干。
( 3 ）主要指标
白仍粉夫，活力回收为65 . 7 % ，蛋白质回收率为17 %。
