蛋白酶是一种生物催化剂，水解蛋白质肤键，产生分子量较小的肤。目前，常用的蛋白酶有：动物来源的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶；微生物来源的细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶；植物来源的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶。蛋白酶主要应用于医药、食品、化妆品、环境保护及科学研究等范围。
生姜是茎类蔬菜，除用于食品烹调外，工业上也用于加工调味姜乳、透明姜汁饮料、生姜汁淀粉、姜蓉辣酱及姜埋奶等。近年来，酶作为生物催化剂逐渐应用于食品加工、药品制造、有机合成、环境保护等行业，需求量逐渐增加。生姜蛋白酶是从生姜中提取的一种新型的水解蛋白质的催化剂，与木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶等属于丝氨酸家族蛋白酶，能特异水解由脯氨酸氨基组成的肽键，目前用于提高啤酒、葡萄酒的澄清度，制造姜埋奶和大豆肤等，是一种非常有工业化应用前景的蛋白酶。生姜蛋白酶的主要酶学性质是：以酪蛋白为底物时，其Km值为0.270mmol / L ，最适pH 值为6.0 ，作用温度范围为30-72 ℃ ，最适温度为60 ℃ ；激活剂为二硫苏糖醇（DTTG ）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA –Na2 ）和DTT ；抑制剂分别是对氯汞苯甲酸（PCMB ）、氯化锌、硫酸铜等。
生姜蛋白酶是蛋白质，溶解于磷酸盐缓冲液中，将溶解有该酶的磷酸盐缓冲液进行盐析、透析、离子交换、反胶束萃取等，可选择性除去杂蛋白，获得精制的生姜蛋白酶制品。
目前制备生姜蛋白酶的方法主要有两种：一种是反胶束萃取法；另一种是以生姜丙酮干粉为原 料的制备方法。两种方法各有特点，现分别介绍如下。
实例236 反胶束萃取制备生姜蛋白酶
蔡海燕等开发的反胶束萃取纯化生姜蛋白酶工艺，以阴离子反胶束从粗酶提取液中进行分离纯化生姜蛋白酶，其主要优点是选择性较高，可在室温下进行处理，反胶束经处理后可再次回用。
( 1 ）工艺流程
( 2 ）主要步骤
① 粉碎、提取 称取Ikg 采摘3 天以内的新鲜生姜块茎，切成约1cm * 1cm 小块，加入4L 温度为4 ℃ 、pH 值为6 .0的0.2mol / L 磷酸缓冲液，置于高速组织匀浆机中粉碎，8 层纱布过滤。收集滤液，滤渣再次用6L 上述缓冲液分两次进行匀浆粉碎处理，同法过滤，弃滤渣，合井滤液。
② 盐析 将收集的滤液用离心机以4000r / min 的转速离心10min ，收集上清液，加入饱和硫酸按溶液进行盐析，使上清液中的硫酸钱终饱和度达到60 %时止。
③ 脱盐 将盐析液用离心机以4 000r / min 转速离心15min , 收集不溶物用少量pH 7 . 50 的柠檬酸缓冲液溶解，在4 ℃ 下对同种缓冲液透析脱盐8h ，获得粗生姜蛋白酶提取液。
④ 萃取除杂 取1L 粗生姜蛋白酶提取液，加入等体积0 . 05 mol / L 的AOT -异辛烷反胶束液，用电动搅拌器以2OOr / min 搅拌萃取5min ，以除去提取液中的部分杂蛋白。4000r / min 离心10min，收集萃余液，再次用等体积0.05mol / L 的AOT-异辛烷反胶束液同法萃取及分离。
收集荷载有杂蛋白的AOT －异辛烷反胶束，用等体积的0 . lmol / L NaCI 溶液反萃取3 次，除去荷载的杂蛋白后用离心机以4000r / min 转速离心10min ，弃下层水相，上层反胶束可再次用于萃取杂蛋白。
① 萃取蛋白酶 向除去部分杂蛋白的萃余液中加入等体积的0.lmol / L 的CTAB 庚烷-辛醇反胶束液，用电动搅拌器以2 00r /min 。搅拌萃取15min ，然后用离心机以4000r / min 转速离心10min , 分别收集上层CTAB 庚烷-辛醇反胶束液及下层萃余液。向萃余液中加入等体积的0．1mol / L 的CTAB 庚烷-辛醇反胶束液，用电动搅拌器以200r / min 搅拌再次萃取1 弓m 谊，然后用离心机以400Or / min 转速离心10min ，分别收集上层CTAB 庚烷-辛醇反胶束液及下层萃余液。
② 反萃取 合并荷载有生姜蛋白酶的CTAB 庚烷-辛醇反胶束液，用等体积0 . lmol / L NaCI 溶液反萃取3 次，条件同萃取。然后用离心机以4000r / min 转速离心10min ，分别收集上层CTAB 庚烷一辛醇反胶束液及下层反萃取液。
⑦ 超滤浓缩 将下层反萃取液用截留分子量2XI 的超滤器进行超滤浓缩，浓缩至反萃取液体积的工／5 时装入冻干瓶中，于-60～-50 ℃ 、真空度为2 0～50Pa 条件下干燥24h ，获得生姜蛋白酶冻干粉。
( 3 ）主要指标
白色粉末，生姜蛋白酶总回收率为60 . 25 % ，其比活力为49 . 77U ／μg 蛋白质。
实例237 生姜丙酮干粉制备生姜蛋白酶
代景泉和黄雪松开发出分离纯化生姜蛋白酶的方法，该方法的特点是首先制备生姜丙酮干粉，再进行磷酸盐提取，接下来进行阴离子交换，最后获得精制生姜蛋白酶产品。
( 1 ）工艺流程
生姜鲤生姜丙酮千粉～提取液巫丝，盐析沉淀～透析液鲤离子交换纯化液～生姜蛋白酶粉
( 2 ）主要步骤
① 制备生姜丙酮干粉称取定量生姜，洗净晾干后切成1cm2小块，与-20 ℃ 冷丙酮混合。冷丙酮的体积（ml 力用量为生姜质量（g ）的5 倍。用组织捣碎机以16000r / min 转速粉碎5min 。
真空抽滤，收集滤渣分散后于室温下风干至无丙酮味。过200目不锈钢筛网，收集过筛粉末，即得生姜丙酮干粉。其收得率为8%。
② 制备生姜蛋白酶称取定量生姜丙酮干粉，加入其质量( g ) 20 倍体积（mL ）、pH 8 . 0 的0 . lmol / L 磷酸缓冲液（含0 . 5mmol / L DTT , 2mmol / L EDTA ) ，搅拌浸提5min 。然后用绢布过滤，弃滤渣，收集滤液。
③ 盐析在搅拌下，10min之内向滤液中加入固体硫酸铵，直至达到30 ％饱和度，继续搅拌30min 后用离心机在4000r / min 转速下离心30min，收集沉淀置于透析膜中对NH ' OH 透析2h , 再对蒸馏水透析到无so 三检出时止。
④ 离子交换纯化 将活化的DE-52树脂（对生姜蛋白酶的交换容量为14.25U／g树脂）或DEAE-纤维素阳离子交换树脂（对牛姜蛋白酶的交换容量为1.2U / g 树脂）装柱，再分别用pH 值为8.16 、0.2mol / L NaCI 平衡或用pH 值为7.68 、0.01mol / L Tris-HCI 缓冲液（含2.3mol / L NaCI )平衡，接着将透析液加入，用0.05-lmol /L NaCI 溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为0 . 75cm3 / min ，收集有生姜蛋白酶活性的洗脱液，进行浓缩、干燥。
( 3 ）主要指标
白色粉末，生姜蛋白酶的收得率为2 .3 % ，总纯化倍数达到23 . 64 倍。
此外，张平平等也开发了分离纯化生姜蛋白酶的方法，其主要步骤与代景泉等的工艺接近，因而不再叙述。
